2015-08-13
687
Разработаны многочисленные методы иммобилизации. На рис. 32.4 показаны важнейшие из них. Ферменты могут связываться с носителем химически (ковалентно), а также физически — путем адсорбции или путем закрепления на носителе за счет электростатических взаимодействий. Под действием специальных реагентов молекулы ферментов могут соединяться между собой (образуя «сеть»). Их удается также механически заключать в гели или микрокапсулы. Путем иммобилизации можно повлиять на характерные свойства того или иного фермента, например его активность, стабильность, оптимальную рабочую температуру, оптимальное значение рН, а также способность связываться с субстратом.
Рисунок 32.4. Основные способы получения иммобилизованных ферментов.
Ковалентное связывание с активированными полимерами. Иммобилизация ферментов путем их ковалентного связывания с активированными полимерами представляет собой, вероятно. Наиболее широко распространенный метод, т.к. несмотря на его трудоемкость, он позволяет получить иммобилизованный фермент, прочно связанный с полимерным носителем.
Сополимеризация с помощью многофункциональных групп. Многофункциональные реагенты можно использовать не только для присоединения молекул фермента к целлюлозе или другим полимерам, но и для связывания молекул фермента друг с другом. К наиболее широко используемым многофункциональным реагентам относится глутаровый альдегид. Гелеобразующее действие альдегидов было отмечено Бэйкером ещё в 1910 году. По существу, это старое наблюдение не утратило своего значения и сегодня. Для того, что бы получить нерастворимую матрицу, состоящую из фермента и глутарового альдегида, необходимо либо заполимеризовать глутаровый альдегид, либо осадить фермент. В результате увеличивается длина связывающей молекулы или уменьшается расстояние между молекулами фермента. Основной недостаток методов такого типа заключается в том, что бифункциональные реагенты часто очень хорошо взаимодействуют с активным центром фермента, тем самым инактивируя его. Однако в тех случаях, когда это удаётся избежать, например, путём обратимого блокирования активного центра, метод даёт хорошие результаты.
Физическая адсорбция. Самым старым из применяемых методов иммобилизации ферментов является физическая адсорбция на полимерной матрице без ковалентного связывания. Осуществить такую адсорбцию чрезвычайно просто: адсорбент и фермент в течение некоторого времени перемешивают вместе. Однако выход связанного фермента мал, и при этом фермент частично или полностью инактивируется. Применялось множество различных адсорбентов. Сорбция может происходить с помощью ионных, гидрофобных и водородных связей, а также за счёт вандерваальсовых сил. Недостатком такого метода является то, что обратимая природа связывания фермента с носителем в самый ответственный момент может привести к его десорбции. Одной из причин, часто вызывающих десорбцию фермента, служит добавление субстрата. Это особенно трудно предотвратить, т.к. остальные факторы, способные вызывать десорбцию такие, как изменение рН, температуры, или ионной силы можно контролировать, но ни один фермент не функционирует без своего субстрата.
Пространственное разделение. Для пространственного разделения молекулы фермента и свободного раствора можно использовать один из 3 методов:
1. Включение фермента в матрицу полимера с большим числом поперечных связей.
2. Отделение фермента от фазы свободного раствора с помощью полупроницаемых «микрокапсул».
3.Растворение фермента в отдельной неводной фазе.
Важной особенностью первых двух способов заключается в том, что фермент фактически ни к чему не прикрепляется. Благодаря этому отсутствуют стерические помехи, возникающие при ковалентном и электростатическом связывания фермента с полимером.
