Визначення спектрів поглинання гемоглобіну

Матеріали, реактиви, обладнання:

розчин гемоглобіну людини, дистильована вода, мірні колби на 50, 100, 200 мл, фотометр КФК-3.

Аналіз спектрів поглинання широко застосовується при дослідженні гемоглобіну – основного компоненту еритроцитів. Функція гемоглобіну полягає у зворотному зв’язуванні молекулярного кисню і транспортуванні його до всіх клітин організму. Гемоглобін відноситься до складних білків – гемопротеїдів. Його молекула складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів (2 α- і 2 β-ланцюги). Кожен ланцюг зв’язаний з гемом, в якому розміщений іон двовалентного заліза.

При поглинанні кисню β-ланцюги гемоглобіну зближуються, при віддачі – розходяться. Розміщення α-ланцюгів при цьому мало міняється. Приєднання і віддача кисню молекулою гемоглобіну супроводжується структурними змінами, що приводить до зміни спектрів поглинання гемоглобіну. Відомі також інші похідні гемоглобіну – метгемоглобін і карбоксигемоглобін. В метгемоглобіні залізо знаходиться в трьохвалентному стані, в той час як в дезоксигемоглобіні і оксигемоглобіні – в двохвалентному. Кількість метгемоглобіну в крові людини збільшується при радіоактивному опроміненні, при попаданні в організм великої кількості нітратів з їжею. При взаємодії з СО гемоглобін зв’язує його і переходить в карбоксигемоглобін. Концентрація карбоксигемоглобіну в крові підвищується при отруєні чадним газом, при курінні.

Кожна форма гемоглобіну характеризується певним спектром поглинання, який є залежністю оптичної густини від довжини хвилі λ.

Характерний спектр поглинання оксигемоглобіну складається із таких смуг: 414 нм (пік Соре), 576-578 (α-смуга) і 542-544 нм (β-смуга). Інтенсивність двох останніх значно менша інтенсивності піку Соре. Між α- і β-смугами знаходиться мінімум при 560 нм. Відношення поглинання при 542 нм до поглинання при 560 нм становить 1,60-1,68. Ця величина має назву коефіцієнт Гюфнера.

Максимум поглинання при 920 нм дає можливість відрізнити оксигемоглобін від карбоксигемоглобіну. Крім того, пік Соре для карбоксигемоглобіну зсунутий до 422 нм, а максимуми α і β знаходяться при 570 і 540 нм.

В спектрі поглинання дезоксигемоглобіну виділяють максимум при 429 нм (пік Соре), а наступний єдиний максимум виявляється при 556 нм.

Для лужних розчинів метгемоглобіну положення максимумів при 417, 540 і 578 нм мало відрізняється від оксигемоглобінових, але їх інтенсивність значно нижча.

Кислі розчини метгемоглобіну мають вузьку смугу поглинання при 500 нм, широку – в області 630 нм, а смуга Соре зсунута в більш короткохвильову область – 405 нм.

Таким чином, при вивченні спектрів поглинання гемоглобіну можна не тільки визначити його концентрацію в розчині, але й проаналізувати, в якій формі він знаходиться, визначити кінетику переходу від одної форми до іншої.

В даній роботі для дослідження спектрів поглинання гемоглобіну використовується фотометр КФК-3. Фотометр КФК-3 застосовується для вимірювання коефіцієнтів пропускання і оптичної густини прозорих розчинів і прозорих твердих зразків, а також для вимірювання швидкості зміни оптичної густини речовини і визначення концентрації речовини в розчинах. Спектральний діапазон фотометра від 315 до 990 нм. В якості диспергуючого елемента у фотометрі застосовується дифракційна решітка. Спектральний інтервал, який виділяється монохроматором, не перевищує 7 нм.

Мікропроцесорна система забезпечує виконання наступних задач:

«НУЛЬ»	- вимірювання і врахування сигналу при неосвітленому фотоприймачеві;
«Г»	- градуювання фотометра (визначення вихідного сигналу фотоприймача);
«Е»	- вимірювання оптичної густини;
«П»	- вимірювання коефіцієнта пропускання;
«С»	- вимірювання концентрації;
«А»	- вимірювання швидкості зміни оптичної густини;
«Г»	- введення коефіцієнта факторизації.

Принцип дії фотометра КФК-3 оснований на порівнянні світлового потоку І₀, що проходить через розчинник, і світлового потоку І, що проходить через розчин досліджуваної речовини.

Світлові потоки І₀ та І перетворюються фотоприймачем в електричні сигнали U₀, U і U_T (U_T – сигнал при неосвітленому фотоприймачеві), які обробляються мікро-ЕОМ фотометра і висвічуються на цифровому табло у вигляді значень коефіцієнта пропускання, оптичної густини, швидкості зміни оптичної густини, концентрації.

Коефіцієнт пропускання (τ) досліджуваного розчину визначається як відношення світлових потоків або сигналів:

Оптична густина (D):

Швидкість зміни оптичної густини:

де D₂-D₁ – різниця значень оптичної густини за час t в хвилинах. Час t може приймати значення 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 хвилин.

Концентрація:

С= D·F,

де F – коефіцієнт факторизації, що визначається дослідником і вводиться з цифрової клавіатури в межах від 0,001 до 9999.

Оптична схема фотометра КФК-3 показана на рис. 3.3.

Дифракційна решітка і дзеркало створюють в площині діафрагми Д₂ розтягнуту картину спектру. Повертаючи дифракційну решітку навколо осі, паралельної штрихам решітки, щілиною діафрагми Д₂ виділяють промені будь-якої довжини від 315 до 990 нм. Об’єктив створює в кюветному відділенні слабозбіжний пучок світла. Лінза зводить пучок, що пройшов кюветне відділення, на фотоприймачі у вигляді рівномірно освітленого світлового круга. В кюветному відділенні при роботі встановлюються прямокутні кювети з досліджуваним розчином.

Хід роботи

Готують розчин невідомої форми гемоглобіну, який відповідає закону Бугера-Ламбетра-Бера, в дистильовані воді. Розчин наливають в односантиметрову кювету. В другу кювету наливають дистильовану воду. Потім роботу проводять на фотометрі в режимі вимірювання оптичної густини. Для цього кювети розміщують у кюветному відділенні. Переводом ручки кюветного відділення у світловий пучок поміщають кювету з водою. Поворотом ручки, зв’язаної з дифракційною решіткою, встановлюють необхідну довжину хвилі, значення (в нм) при цьому висвітлюється на верхньому цифровому табло. Далі при закритій кришці кюветного відділення натискають послідовно клавішу «Г» і клавішу «Е». При цьому на табло з’являється значення «0,000±0,002». Це означає, що початковий відлік оптичної густини встановився на фотометрі правильно. Після цього при відкритій кришці натискають клавішу «НУЛЬ», закривають кришку і натискають клавішу «Е». На табло з’являється значення «0,000». Таким чином враховано густину поглинання розчинника (в даному випадку води) і нульовий відрахунок. Далі поворотом ручки кюветного відділення в світловий пучок переводять кювету з розчином гемоглобіну. При цьому на табло з’являється значення оптичної густини при заданій довжині хвилі.

Для побудови спектральної кривої необхідно визначити оптичну густину розчину в інтервалі від 350 до 700 нм, змінюючи кожен раз довжину хвилі на 5 нм результати оформлюють на міліметровому папері у вигляді графіку залежності D від λ.

Після побудови спектральної кривої необхідно проаналізувати на ній максимуми і мінімуми поглинання і визначити, в якій формі знаходиться гемоглобін, його фізико-хімічний стан.

Контрольні запитання.