Б. Открытие каталазы в слюне

Биохимия смешанной слюны

Работа 1. Определение рН слюны

Ход работы. На диагностическую полоску бумаги или на полоску универсальной индикаторной бумаги наносят каплю слюны и тотчас сравнивают с эталонной шкалой. Результат заносят в таблицу, приведенную в конце описания лабораторных работ.

 

Работа 2. Определение минеральных компонентов слюны

А. Определение хлоридов.

Ход работы. В пробирку вносят 10-15 капель слюны, добавляют 2-3 капли 30%-ного раствора азотной кислоты и 3-4 капли 1%-ного раствора нитрата серебра. Образуется творожистый осадок серебра. Написать реакцию.

Б. Обнаружение ионовСа²⁺.

Ход работы. К 1 мл слюны добавить 1-2 капли 3%-ного раствора уксусной кислоты и 1-2 капли 4%-ного раствора оксалата аммония. Выпадает осадок щавелевокислого кальция:

 

Са²⁺ + (NH₄)₂C₂O₄ → CaC₂O₄↓ + 2NH₄⁺

В. Обнаружение фосфатов.

Принцип метода. При взаимодействии молибденовокислого аммония с фосфорной кислотой в присутствии азотной кислоты появляется кристаллический лимонно-жёлтый осадок фосорномолибденовокислого аммония.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл молибденового реактива, нагревают почти до кипения. После этого добавляют 10-15 капель слюны. При стоянии выпадает желтый осадок фосорномолибденовокислого аммония, не растворимый в азотной кислоте:

 

12 (NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ → 21NH₄NO₃ + (NH₄)₃PO₄*12MoO₃*6H₂O↓ + 6H₂O

 

Г. Обнаружение роданидов.

Принцип метода. Роданиды обнаруживаются по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хлорида железа (III). Образуется красное комплексное соединение, содержащее железо и роданид:

Fe³⁺ + CNS^- → Fe(CNS)₃

Ход работы. В маленькую пробирку вносят 5 капель слюны (только что взятой), 2 капли 2%-ного раствора хлористоводородной кислоты и 2 капли раствора хлорида железа (III). Появляется красное окрашивание, интенсивность которого зависит от содержания в слюне роданидов. Особенно яркое окрашивание наблюдается у курильщиков. Сравните!

 

Работа 3. Открытие органических компонентов слюны

А. Выделение муцина слюны и определение в нем углеводного компонента.

Муцин относится к гликопротеидам, т.е. сложным белкам, имеющим в составе углеводы и липидный компонент. Раствор муцина обладает большой вязкостью, благодаря чему пищевой комок делается скользким, легко проглатывается и продвигается по пищеводу.

Муцин осаждается концентрированной уксусной кислотой. Углеводный компонент обнаруживается реакцией с α-нафтолом (реакция Молиша). Реакция Молиша основана на дегидратации пентоз и образовании фурфурола при действии концентрированной H₂SO₄. Образовавшийся фурфурол в присутствии H₂SO₄ дает с α-нафтолом продукт конденсации розово-фиолетового цвета.

Ход работы. В пробирку собирают около 2 мл слюны и прибавляют по каплям концентрированную уксусную кислоту (4-5 капель, избегать избытка кислоты). Выпадает осадок муцина. Сгусток вынимают стеклянной палочкой, помещают в другую пробирку и проделывают реакцию Молиша: к сгустку добавляют 4-5 капель спиртового раствора α-нафтола, перемешивают и по стенке слаивают около 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости постепенно появляется фиолетово-красное кольцо.

Оставшийся в первой пробирке после удаления сгустка муцина раствор, содержащий все белки, кроме муцина, фильтруют. Фильтрат делят на две части. С одной проделывают биуретовую реакцию, а к другой прибавляют 1/3 объёма насыщенного раствора сульфата аммония и кипятят. Выпадает осадок белка.

Б. Открытие каталазы в слюне

Каталаза (КФ 1.11.1.6) осуществляет разрушение пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода и воды:

 

2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂

 

Ход работы. К 1 мл слюны добавляют 1 мл 1%-ного раствора пероксида водорода. Наблюдают медленное выделение пузырьков кислорода.

В. Пробы на глюкозу в слюне. Качественные реакции на глюкозу в слюне (реакции Феллинга и Ниландера) как правило отрицательны. Но при заболеваниях, сопровождающихся гипергликемией (сахарный диабет, тиреотоксикоз и др.), или после приема пищи, богатой углеводами, пробы на глюкозу могут быть положительны.

Ход работы. На диагностическую полоску наносят каплю слюны и сравнивают с эталонной шкалой. Можно проделать реакцию Феллинга. 1 мл слюны собрать в пробирку, добавить 0,5 мл реактива Феллинга и довести до кипения. При наличии глюкозы в слюне образуется красный осадок оксида меди (I).

Г. Реакция на молочную кислоту. При некоторых заболеваниях полости рта в смешанной слюне может содержаться в повышенном количестве молочная кислота, что является фактором риска развития кариеса.

Принцип метода. При добавлении молочной кислоты к свежеприготовленному раствору фенолята железа аметистового цвета образуется лактат железа желто-зеленого цвета.

Ход определения. К 15 мл раствора фенола добавить несколько капель хлорида железа (III). Перемешать. Получившийся реактив аметистового цвета разбавить водой до слабой окраски. В 3 пробирки налить по 15 капель полученного реактива. В первую пробирку добавить по каплям раствор молочной кислоты. Во вторую - 1 мл свежевзятой слюны, а в третью – слюну с добавлением раствора молочной кислоты. Сравните свои наблюдения. Сделайте выводы.

Оформление работы. Полученные результаты качественного анализа слюны оформить в виде таблицы.

 

Название работы	Применяемые реактивы, условия реакции	Наблюдаемые явления	Чем обусловлены реакции

 

Работа 4. Количественное определение активности амилазы слюны по Вольгемуту

Амилаза (диастаза) – фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы. Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой слюнные и поджелудочная железы. Амилаза содержится также и в крови, куда попадает, главным образом, из поджелудочной железы.

Принцип метода. Метод основан на том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и то же количество раствора крахмала и находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала. Затем производят перерасчет активности фермента на 1 мл слюны. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1%-ного раствора крахмала в миллилитрах, которое может расщепляться 1 мл слюны при температуре 37˚С в течение 30 минут.

В норме амилазная активность слюны составляет 320-640 ед.

Ход работы. В 10 пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл воды. В 1-ю пробирку добавляют 1мл слюны, разведенной в 10 раз. Содержимое пробирки перемешивают и 1мл раствора переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают и из второй – таким же образом в 3-ю и т.д. до 10-й пробирки. Из десятой пробирки 1 мл смеси выливают. Таким образом получается ряд разведенной слюны, в котором в каждой последующей пробирке содержится фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все пробирки добавляют по 1мл воды и по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, перемешивают и помещают пробирки в водяную баню на 30 минут при температуре 37˚С.

Через 30 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 1-2 капли 1%-ного раствора йода и перемешивают. Жидкость в пробирках может окрашиваться в желтый, красный и фиолетовый цвет. Раствор желтого цвета свидетельствует о полном расщеплении крахмала, фиолетовый – что крахмал в растворе еще сохранился.

Оформление работы. Работу необходимо оформить в виде таблицы.

 

№№ пробирок
Разведение слюны
Количество мл.0,1%-ного раствора крахмала
Окрашивание йодом
Амилазная активность слюны

 

Расчет: Для расчета берется количество слюны в последней пробирке желтой окраской. Если это 4-я пробирка, то разведение в ней слюны в 160 раз. Составляется пропорция:

1/160 мл слюны расщепляет 2 мл 0, 1%-ного раствора крахмала

1 мл слюны расщепляет Х мл 0,1%-ного раствора крахмала

 

Х=2х160=320 мл 0,1%-ного раствора крахмала.

Следовательно, амилазная активность слюны равна 320 условным единицам