Биоинформатическая часть

Экспериментальная часть

Задача- отсеквенировать плазмиду Ps2 длиной более 70кб. Фрагменты(двумя наборами рестриктаз EcoRI-HindIII, EcoR1-BamHI-BgIII), лигировать с вектором pBlueScript (по липким концам, так эффективнее) с образованием небольших плазмид.

Плазмиды нужно трансформировать в компетентные клетки(Бактерия, находящаяся в таком физиологическом состоянии, когда она может воспринимать экзогенные молекулы ДНК, т.е. быть рецепиентом ДНК при трансформации; К.к. широко используются в генной инженерии в качестве рецепиентов векторных плазмид). Трансформированные клетки вырастали на чашке с ампициллином (pBlueScript несет ген устойчивости к ампициллину), при этом клетки, содержащие вставку в плазмиде были белого цвета, а клетки, не получившие вставки, были синими (на чашке присутствовал IPTG – индуктор лак-оперона, и X-gal- аналог лактазы, который при расщеплении образует вещество синего цвета. Система работает из-за присутствия в векторе гена бета-галоктозидазы, который имел место для вставки фрагмента в середине гена)

Чтобы проверить наличие и длину вставки в колонии, ставили ПЦР с праймерами на концах вставки. Праймеры (искусственно синтезированные олигонуклеотиды, комплиментарные соответствующим участкам ДНК-мишени..)называются m13F и m13R. В случае,если вставка была длиннее 1000 нк, отПЦРеныый фрагмент очищали от примесей с помощью колонки с силикой. Таким образом было очищено около 50 пцр фрагментов различной длины. Эти фрагменты и были отправлены на сиквенс.

Другим способом получения сиквенсов со вставок было выделение целых плазмид из ночной культуры клеток (ночная культура – это сколотая единичная белая колония, растворенная в жидкой питательной среде). За ночь клетки нарастают до миллиарда штук, таким образом, в каждой пробирке мы имеем миллиарды копий одинаковых плазмид со вставкой. Плазмиды из клеток выделяли с помощью колонки с силикой. Плазмиды, содержащие вставку, были отправлены на секвенирование. Итого- 40 пцр фрагментов и 40 плазмид, все пцр фрагменты были прочитаны с двух сторон, все плазмиды-только с одной(с forward стороны), всего 120 сиквенсов.

 

Биоинформатическая часть

 

Было получено 120 сэнгеровских сиквенсов

С помощью программы Chromas мы могли оценить качество сиквенса (не смесь ли это – по пикам)

С помощью программы SeqMan были получены 23 контига средней длиной 1000 нк

С помощью программы Вlast ORFfinder были найдены открытые рамки считывания (ORF open reading frame), которые были отбластованы (blastp метод по умолчанию)

Все эти ORFs в следующие функциональные группы белков:

Предсказанные белки	34.62%
Другие белки	26,92 %
колицины	13,46%
Транспозоны	11, 54%
Микроцин б	7,69
репликация	5,77%

 

Биоинформатическая часть 1 Illumina MiSeq секвенирование

На секвенирование нового была отправлена целая плазмида pS2.

Ее расщепили ультрозвуком на фрагменты длиной около 500 нк(нормальное распределение длин с максимумом в 500 нк), этот максимум вырезали из геля и очистили. Далее запустили прибор, который с двух сторон читал фрагменты. Весь процесс запуска и форматирования данных занял 48 часов

После чего с помощью программы CLC Genomics Databench данные с Illumina были собраны в несколько групп контигов:

	count	Average length	Total bases
Matched
Not matched
Contings
Reads in pairs
Broken paired reads

 

Параметры, которые мы меняли – быстрая/медленная сборка и минимальная длина контига. После нескольких пробных сборок мы выбрали ту, из которой потом выбрали 6 контигов (5, собравшихся с SeqMan в один контиг, и 1 – хромосомная ДНК, содержавшая 16S Ррнк)

Контиг прогнали в Blast ORF finder,найденные ORFs классифицировали по белковым семействам.