Спектральный анализ биологических объектов

Метод исследования фотобиологических процессов с помощью спектров поглощения называется абсорбционной спектрофотометрией.

Спектрофотометрия (абсорбционная) — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны. Спектрофотометрия широко применяется при изучении строения и состава различных соединений (комплексов, красителей, аналитических реагентов и др.), для качественного и количественного определения веществ (определения следов элементов в металлах, сплавах, технических объектах). Спектры поглощения получают с помощью специальных приборов – спектрофотометров.

Фотоколориметрия — количественное определение концентрации вещества по поглощению света в видимой и ближней ультрафиолетовой области спектра. Поглощение света измеряют на фотоэлектрических колориметрах.

Атомы каждого химического элемента имеют строго определённые резонансные частоты, в результате чего именно на этих частотах они излучают или поглощают свет. Это приводит к тому, что в спектроскопе на спектрах видны линии (тёмные или светлые) в определённых местах, характерных для каждого вещества. Интенсивность линий зависит от количества вещества и его состояния. В количественном спектральном анализе определяют содержание исследуемого вещества по относительной или абсолютной интенсивностям линий или полос в спектрах. Оптический спектральный анализ характеризуется относительной простотой выполнения, отсутствием сложной подготовки проб к анализу, незначительным количеством вещества (10—30 мг), необходимого для анализа на большое число элементов. Атомарные спектры (поглощения или испускания) получают переведением вещества в парообразное состояние путём нагревания пробы до 1000—10000 °C. В качестве источников возбуждения атомов при эмиссионном анализе токопроводящих материалов применяют искру, дугу переменного тока; при этом пробу помещают в кратер одного из угольных электродов. Для анализа растворов широко используют пламя или плазму различных газов.

Поток световых квантов, проходя через систему, содержащую молекулы вещества, ослабляется. Ослабление потока квантов происходит вследствие того, что часть квантов поглощается (захватывается) молекулами. Пусть - интенсивность светового потока, т.е. количество квантов, проходящих через данный образец в единицу времени. Ослабление интенсивности света будет зависеть от количества столкновений квантов с молекулами вещества. Очевидно, что число этих столкновений пропорционально числу молекул на пути светового потока, т.е. пропорционально концентрации вещества. С другой стороны, оно должно быть также пропорционально количеству самих квантов, проходящих через систему в единицу времени, т.е. интенсивности светового потока . Если взять достаточно малое расстояние , на котором происходит поглощение, то ослабление интенсивности потока будет пропорционально этому расстоянию. Установленные зависимости можно выразить уравнением:

, (1)

где - коэффициент пропорциональности; знак «минус» перед показывает, что световой поток уменьшается. Уравнение (1) представляет собой линейное дифференциальное уравнение первого порядка. Запишем его в следующем виде:

.

Проинтегрировав левую и правую части, получим:

,

где - толщина образца (длина оптического пути); - константа интегрирования, которую необходимо определить. Пусть , тогда

,

где - интенсивность потока, входящего в вещество. Подставляя значение в предыдущее уравнение, получаем:

, или

. (2)

Отсюда

, (3)

где - основание натуральных логарифмов.

Уравненя (2) и (3) являются выражением закона Ламберта – Бера: интенсивность светового потока, проходящего через вещество, экспоненциально уменьшается в зависимости от длины оптического пути и концентрации вещества в образце.

В уравнении (2) заменим натуральный логарифм на десятичный и новый коэффициент пропорциональности обозночим . Тогда.

. (4)

Десятичный логарифм отношение интенсивности падающего света к интенсивности выходящего из образца, света называется оптической плотностью. Обозночив ее через , получим:

. (5)

В этом случае закон Ламберта –Бера можно сформулировать следующим образом: оптическая плотность образца прямо пропорциональна концентрации вещества в образце и длине светового пути. В уравнении (5) называется молярным коэффициентом поглащения. Если и , то , т.е. – это оптическая плотность образца толщиной в единицу (1 см) при концентрации вещества 1 моль/л.

Оптическая плотность показывает поглощательную способность вещества. Поглощение тем больше, чем больше отношение , т.е. чем больше оптическая плотность.

Вещества неодинаково поглощает свет различной длины волны. Кривая зависимости оптической плотности вещества от длины волны поглощаемого света называется спектром поглощения. обычно спектры поглощения молекул имеют непрерывный характер, но обнаруживают максимумы на той длине волны света, где имеется максимальное поглощение квантов света.

Изучение спектров поглощения какого-либо фотобиологического процесса позволяет выяснить, какое вещество ответственно в данном процессе за поглощение света. Это достигается в результате сравнения спектров исследуемого процесса и спектров известных веществ. Кроме этого, по положению максимумов на шкале длин волн можно определить длину волны света, преимущественно поглощаемого этим веществом. Знание длины волны поглощаемого света позволяет определить энергию поглощаемых квантов. А по величине энергии поглощаемых квантов можно рассчитывать расположение электронных и колебательных энергетических уровней молекулы, а также переходы молекул из одного энергетического состояния в другое. Кроме всей этой информации, величина оптической плотности дает сведения о концентрации вещества в исследуемой пробе. По величине максимумов поглощения на основании уравнения (5) можно делать заключения о концентрации вещества в исследуемом объекте.

Контроль