Критически оцените причины возникновения устойчивости м/о к антибиотикам

Устойчивость к антибиотикам — вовсе не внезапно появившееся свойство микробов. В прошлом году американские исследователи обнаружили пещеру, микроорганизмы из которой были изолированы от мира на протяжении 4 млн лет. Несмотря на это, бактерии Paenibacillus из этой пещеры уже обладали резистентностью к 18 современным антибиотикам и в том числе — к некоторым из числа препаратов «последней надежды».

Гены резистентности к антибиотикам, как и сами антибиотики, существуют с древних времен. Гены, обеспечивающие резистентность известны как экологическая резистома. Эти гены могут быть перенесены от не болезнетворных бактерий к тем, которые действительно вызывают болезни, что приводит к клинически значимой резистентности к антибиотикам. В 1952 г. было показано, что бактерии, устойчивые к пенициллину, существовали до начала лечения пенициллином. В 1962 г. наличие пенициллиназы было обнаружено в покоящихся эндоспорах бактерий Bacillus licheniformis, которые были оживлены из высушенной почвы на корнях растений, хранившихся с 1689 г. в Британском музее

Резистентность возникает одним из трех способов: природная резистентность у некоторых типов бактерий; генетическая мутация; или путем приобретения резистентности одними видами бактерий от других. Резистентность может появляться спонтанно вследствие произвольных мутаций; или чаще всего в результате постепенного накопления со временем, и из-за неправильного применения антибиотиков или противомикробных препаратов.

Существует так природная резистентность бактерий к тем или иным антибиотикам. Причина - для данного антибиотика у м/о просто нет мишени, или мембрана у бактерии такая специфическая, что именно эта молекула лекарства через нее не проникает и т. п.

   Устойчивость микроорганизмов к действию антибиотиков вызвана несколькими причинами. В основном они сводятся к следующим. Во-первых, в любой совокупности микроорганизмов, сосуществующих на каком-то определенном участке субстрата, встречаются естественно устойчивые к антибиотикам варианты (примерно одна особь на миллион). При воздействии антибиотика па популяцию основная масса клеток гибнет (если антибиотик обладает бактерицидным действием) или прекращает развитие (если антибиотик обладает бактериостатическим действием). В то же самое время устойчивые к антибиотику единичные клетки продолжают беспрепятственно размножаться. Устойчивость к антибиотику этими клетками передается по наследству, давая начало новой устойчивой к антибиотику популяции. В данном случае происходит селекция (отбор) устойчивых вариантов с помощью антибиотика.

Во вторых, у чувствительных к антибиотику микроорганизмов может идти процесс адаптации (приспособления) к вредному воздействию антибиотического вещества. В этом случае может наблюдаться, с одной стороны, замена одних звеньев обмена веществ микроорганизма, естественный ход которых нарушается антибиотиком, другими звеньями, не подверженными действию препарата. При этом м/о также не будет подавляться антибиотиком. С другой — микроорганизмы могут начать усиленно вырабатывать вещества, разрушающие молекулу антибиотика, тем самым нейтрализуя его действие. Например, ряд штаммов стафилококков и спороносных бактерий образует фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин с образованием продуктов, не обладающих антибиотической активностью= энзиматической инактивацией антибиотиков.

Существует много противоречивых теорий, которые пытаются объяснить происхождение устойчивости к лекарственным веществам. В основном они касаются вопросов о роли мутаций и адаптации в приобретении устойчивости.

 

Обобщите механизм действия пенициллинов, свойства, получение и применение.

Молекула пенициллина состоит из двух колец — тиазолидинового и бета-лактамного. Вместе = пенициллиновое ядро= биологическуая активность пенициллинов. При малейших изменениях и структуре этой части молекулы антимикробные свойства препаратов пропадают. С бета-лактамным кольцом связан боковой радикал, определяющий многие фармакологические свойства препарата. У природных пенициллинов строение радикала зависит от состава среды, на которой растут Penicillium spp. Самой высокой антимикробной активностью среди природных пенициллинов обладает бензилпенициллин — кроме феноксиметилпенициллина, он единственный природный препарат, который применяют в лечебной практике.

Вскоре ученые обнаружили, что если удалить из среды, на которой выращивают Penicillium chrysogenum, предшественники боковых радикалов, то впоследствии из нее можно выделить 6-аминопенициллановую кислоту. Присоединяя затем к молекуле этой кислоты другие боковые радикалы, можно получить пенициллины, отличающиеся по чувствительности к β-лактамазам, антимикробной активности и другим фармакологическим свойствам. Сегодня 6-аминопенициллановую кислоту получают в больших количествах из Penicillium chrysogenum, используя для этого бактериальную амидазу. Этот фермент расщепляет пептидную связь, которая соединяет боковой радикал с 6-аминопенициллановой кислотой

Бета-лактамные антибиотики оказывают бактерицидное действие на чувствительных микроорганизмов. Механизм этого действия до конца не изучен, но полученные на сегодня данные уже позволяют понять основные его закономерности (Tomasz, 1986; Ghuysen, 1991; Bayles, 2000).

Мех. Д-я.

Для нормального роста и развития бактериям необходима клеточная стенка. Ее основу составляет гетерополимер пептидогликан; его сетчатая структура с перекрестными сшивками придает клеточной стенке прочность. У Г+ клеточная стенка содержит 50—100 слоев пептидогликана, а у грамотрицательных — только 1—2. Пептидогликан состоит из линейных полисахаридных цепочек, которые построены из чередующихся остатков моносахаридов (N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты) и связаны между собой пептидными мостиками.

На стадии пептидных мостиков образуются путем транспептидирования (транспептидаза). Концевой глициновый остаток пентаглицинового мостика соединяется с четвертым остатком пентапептида (D-аланином) с освобождением пятого остатка (также D-аланина). Предположительно, пенициллины образуют ацильную связь с активным центром транспептидазы и тем самым необратимо ингибируют ее. При этом связь —СО—N— в р-лактамном кольце разрывается, и образуется пенициллоиновая группа.

Транспептидазы — это только один вид белков, на которые действуют β-лактамные антибиотики. В совокупности все эти белки называются пенициллинсвязывающими белками. Они есть у всех бактерий — например, у Staphylococcus aureus их четыре, а у Escherichia coli — по крайней мере семь. Под действием антибиотика происходит инактивация пенициллинсвязывающих белков, что так или иначе приводит к повреждению бактерии. При их инактивации бактерии принимают форму шариков и разрываются. Пенициллинсвязываюший белок 2 также участвует в поддержании формы бактерии, однако при его инактивации бактерия разрушается медленнее, чем при инактивации транспептидаз. Пенициллинсвязывающий белок 3 необходим для образования клеточной перегородки при делении. При его инактивации неразделившиеся бактерии принимают вид длинных тонких нитей. Есть и другие механизмы гибели бактерий. Так, пенициллины нарушают равновесие между синтезом пептидогликана и его разрушением эндогенными пептидогликангидролазами (ауто-лизинами), при этом наступает аутолиз бактерий. Кроме того, пенициллины взаимодействуют с белками цитоплазматической мембраны бактерий, напоминающими белки-холины, — в результате бактериальная клетка деполяризуется.

Получение.

Биосинтез пенициллина осуществляется в три стадии:

На первой стадии происходит конденсация трёх аминокислот: L-α-аминоадиповой кислоты, L-цистеина, L-валина в трипептид. Перед конденсацией в трипептид аминокислота L-валин превращается D-валин. Указанный трипептид называется δ-(L-α-аминоадипил)-L-цистеин-D-валином (англ. ACV).

Вторая стадия биосинтеза пенициллина — это окисление линейной молекулы ACV в двуциклический интермедиат изопенициллин N ферментом изопенициилин N синтетазой (англ. IPNS), продуктом гена pcbC. Изопенициллин N — очень слабый интермедиат, так как он не обладает противомикробной активностью.

На заключительной стадии происходит трансаминирование ферментом изопенициллин N N-ацилтрансферазой, при этом α-аминоадипиловая боковая цепь изопенициллина N удаляется и заменяется на фенилуксусную кислоту. Фермент, катализирующий эту реакцию является продуктом гена penDE.

Подготовка инокулята

1) выращивание посевного мицелия 1-й генерации в аппаратах малой емкости (инокуляторах);

2) выращивание посевного мицелия 2-й генерации в аппаратах большой емкости.

Основной задачей является быстрое получение большой массы мицелия, способного обеспечить при пересеве в ферментер интенсивный рост и высокий выход антибиотика. Для осуществления этой задачи продуцент необходимо выращивать на средах, богатых легкоусвояемыми питательными веществами, в условиях хорошей аэрации, при оптимальной для роста микроорганизма температуре.

Процесс ферментации

В промышленности применяется метод глубинной ферментации,=культура выращивается в питательной среде, заполняя весь ее объем. У различных штаммов потребность в источниках питания неодинакова. В связи с этим состав сред не является постоянным и универсальным для всех продуцентов, образующих пенициллин, и меняется с появлением новых штаммов.

Ферментационная среда должна быть составлена таким образом, чтобы развивающаяся культура, потребляя питательные вещества и выделяя продукты обмена, сама создавала необходимые условия и осуществляла переход от фазы роста мицелия к фазе пенициллин образования. Желательно, чтобы вторая фаза была более продолжительной и чтобы процесс ферментации прекращался до наступления автолиза.

Для этого, как и при выращивании посевного материала необходимо одновременное присутствие в среде как легко-, так и трудноусвояемого углевода. Легкоусвояемый углевод обеспечивает быстрый рост и образование обильной биомассы; трудноусвояемый углевод создает условия, благоприятные для биосинтеза антибиотика.

Исключительно важную роль в обмене веществ клетки играет фосфор, который необходим не только для нормального роста и развития гриба, но и для осуществления самого процесса биосинтеза пенициллина. Для образования пенициллина требуется значительно более высокая концентрация фосфора в среде, чем для роста гриба.

Обязательным компонентом ферментационной среды является сера, входящая в состав важнейших аминокислот и ферментов+ она входит в состав молекулы пенициллина.

Фильтрация

Обычно для отделения мицелия от культуральной жидкости применяют вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Фильтрацию начинают до начала автолиза мицелия, поскольку при фильтрации автолизированной культуры мицелий не образует плотной пленки на фильтрующей поверхности барабана, а налипает в виде отдельных тонких комков, которые сами не отходят в зоне «отдувки» фильтра, и их приходится удалять вручную.

Необходимо тщательно соблюдать условия, препятствующие разрушению пенициллина во время фильтрации, - охлаждение нативного раствора до 4-6°С и систематическая (после каждой загрузки) обработка фильтра, коммуникаций и сборников антисептиками, например хлорамином.