Практическое использование биосинтетической и трансформирующей деятельности микробов

С начала второй половины XX в. изучение синтетической и трансформирующей деятельности микроорганизмов ведется в тесном контакте с их селекцией и широким практическим использованием.

Главными продуктами биосинтетической активности микроорганизмов являются белки, витамины, гиббереллины, полисахариды, аминокислоты, ферменты, энтомопатогенные препараты, кормовые антибиотики. Непременным условием успешного развития этого направления стало ведение селекционной работы – получение и использование высокоактивных штаммов продуцентов, обеспечивающих рентабельность производства. Развитие селекции опирается на теоретический фундамент генетики. За сравнительно короткий срок (примерно 20 лет) при помощи селекционно‑генетических методов были созданы многие высокоактивные штаммы микробов, продуктивность которых была повышена в 10‑200 раз по сравнению с исходными штаммами. Их использование явилось предпосылкой создания ряда отраслей микробиологической промышленности. Классическим объектом селекции стали актиномицеты и грибы.

Начало изучения и использования биосинтетической деятельности микроорганизмов связано с получением пенициллина, который в 1940 г. Г. Флори и Э. Чейн выделили из культуры плесневого гриба, впервые описанного А. Флемингом в 1929 г. (совместная Нобелевская премия, 1945). Этот продуцент был идентифицирован М. Тома как Pénicillium notatum. Однако родоначальником всех высокоактивных штаммов продуцентов пенициллина, используемых в настоящее время, стал P. chrysogeniim.

Существенными нововведениями в производстве пенициллина, значительно повысившими его выход, были: переход с поверхностного выращивания гриба на глубинное (этот новый тип промышленного культивирования приобрел большое значение не только для пенициллиновой, но и для всей микробиологической промышленности); перевод процесса биосинтеза с синтетических питательных сред на богатые питательными веществами среды; введение в ферментационную среду предшественника продукта биосинтеза – осколка пенициллиновой молекулы – фенилуксусной кислоты. Все эти факторы значительно усилили физиологическую активность продуцентов терапевтически наиболее ценного типа пенициллина – бензилпенициллина.

Культура актиномицета – продуцента стрептомицина была впервые выделена в 1914 г. А. Краинским, который подробно описал морфологические и физиологические особенности этого гриба, назвав его Actinomyces griseus. В 1916 г. 3. Ваксман и Р. Куртис выделили другой актиномицет, сходный с предыдущим, отнеся его также к виду Act. griseus. После этого поиски новых продуцентов антибиотиков были возобновлены только в 1943 г., уже после открытия пенициллина и после того, как в 1940 г. 3. Ваксман и X. Вудраф обнаружили у двух видов актиномицетов способность образовывать антибиотические вещества. В 1944 г. Ваксман выделил еще две культуры, продуцирующие стрептомицин (Нобелевская премия, 1952).

В 40‑50‑е годы у микроорганизмов была открыта способность синтезировать и другие антибиотики: окситетрациклин (Act. rimosus, 1948), аурэомицин (биомицин; Str. aureofaciens, 1948), эритромицин (Act. erythreus, 1952), олеандомицин (Act. antibioticus, 1956), грамицидин (Вас. brevis) и т. д. По отношению ко всем продуцентам названных антибиотиков, а также таких антибиотиков, как ванкомицин, ристомицин, канамицин, гризеофульвин, альбомицин, целикомицин, для повышения активности продуцента были применены различные методы селекции.

Столь же успешно исследовалась способность микроорганизмов к синтезу аминокислот. Начало промышленного микробиологического синтеза аминокислот относится к 60‑м годам, когда в Японии в результате обработки УФ‑лучами исходных штаммов Micrococcus glutamicus, выделенного из почвы (С. Киношита, 1956), были получены штаммы, обладавшие высокой биосинтетической активностью. Изучение механизма синтеза аминокислот, вопросов взаимозаменяемости и конкурентности природных аминокислот и их аналогов позволило значительно глубже проникнуть в содержание физиолого‑биохимических процессов, протекающих в микробных клетках. Были установлены явления ретроингибирования, аллостерического торможения при образовании аминокислот, определены места блокирования отдельных этапов биосинтеза у биохимических мутантов, установлены взаимные связи и перекрещивания синтезов различных аминокислот, роль предшественников и т. д.

Изучение биосинтетических путей образования аминокислот микроорганизмами и их селекция интенсивно проводились в течение последнего десятилетия в лабораториях многих стран мира. Микробиологическим путем стали получать аланин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, лизин, метионин, триптофан, лейцин, изолейцин и т. п. По данным С. Киношита (1959) и Н.А. Красильникова (1963), чаще всего в природе встречаются продуценты глутаминовой кислоты и аланина. Анализ путей синтеза аминокислот в клетках показал, что для микроорганизмов характерно восстановительное аминирование пировиноградной кислоты при использовании таких источников углерода, как глюкоза, кислоты цикла Кребса, глицерины, углеводороды; источником аминогруппы является глутаминовая кислота. Образование аланина связано с функционированием аланиндегидрогеназы, обладающей специфичностью по отношению к субстрату и по ответной реакции на воздействие стимулирующих и инактивирующих агентов.

Аспарагиновая кислота, играющая исключительно важную роль в процессах обмена, довольно часто, хотя и в небольших количествах, обнаруживается в культуральной жидкости многих микроорганизмов. Для аспарагиновой кислоты, так же как и для глутаминовой, валина и аланина, характерен синтез путем использования предшественников кетоаналогов и их последующего перевода в аминокислоты ферментными системами клеток. В Японии налажено промышленное производство аспарагиновой кислоты микробиологическим методом на основе превращения фумарата в аспарат Е. coli. При изучении образования глутаминовой кислоты у Pseudomonaso valis были обнаружены два самостоятельные пути ее синтеза – восстановительное аминирование α‑кетоглутаровой кислоты и переаминирование.

Наиболее рациональным способом промышленного биосинтеза лизина оказалось использование мутантов с наследственными нарушениями в цепи превращений аспарагиновой кислоты – исходного продукта для биосинтеза многих аминокислот – лизина, метионина, треонина, изолейцина. В результате сочетания биохимических и генетических методов исследования были получены штаммы, синтезирующие 25–30 мг/мл лизина. Среди биохимических методов производства лизина наиболее широкое применение получил способ исключения из числа возможных его предшественников гомосерина и треонина, а также диаминопимелиновой (ДАП) кислоты – основного предшественника лизина, образующегося путем ее декарбоксилирования. Существенным также оказалось использование мутантов с пониженной требовательностью к аэрации.

Большое внимание уделялось изучению путей микробиологического синтеза кормового белка. В качестве субстрата для выращивания продуцентов – главным образом дрожжей рода Candida – используются углеводороды и гидролизаты растительных отходов. Не менее интенсивно велись поиски возможности использования биосинтетической деятельности микробов для получения препаратов различных ферментов. Основными продуцентами ферментов являются грибы рода Aspergillus, а также некоторые бактерии и актиномицеты.

В небольшом количестве получают амилолитические и протеолитические ферменты и пектиназы. Достаточно хорошо изучены условия биосинтеза таких ферментов, как лактаза, целлюлаза и гемицеллюлаза, фибринолитические ферменты, глюкозооксидаза, нуклеодеполимеразы и др.

Активность ферментов повышают подбором штаммов и условий культивирования, а также методами селекции. Работы в этом направлении широко ведутся в СССР, Японии, США и других странах.

Интенсивное развитие получил также микробиологический синтез органических кислот – лимонной, итаконовой, щавелевой, глюконовой, – наиболее активными продуцентами которых являются аспергиллы; гиббереллинов, основным продуцентом которых служит культура Fusarium moniliforme; витаминов – витамина В₂ (рибофлавина), витамина В₁₂ и эргостерина. Выяснилось, что способностью к синтезу витамина В₂ обладают дрожжи рода Candida, а также некоторые грибы (Ashbya gossypii, Asp., flavus и Asp. niger) и актиномицеты (Act. olivaceus); продуцентами витамина B₁₂ являются пропионовокислые бактерии, Act. olivaceus, а также микробный комплекс метанового биоценоза, практическое использование которого было разработано в нашей стране (В.Н. Букин, В.Я. Быховский, Е.С. Панцхава и др.). Обработка названных продуцентов мутагенными факторами и последующий отбор дали возможность значительно увеличить синтез ими витамина В₁₂.

За последние годы разностороннему изучению и широкому практическому использованию подверглась трансформирующая активность микроорганизмов. Способность некоторых групп микроорганизмов к тонкой трансформации химических соединений, затрагивающей только один‑два атома, нашла применение в тех случаях, когда современная химическая технология еще бессильна. Теоретическую основу развития этого важного раздела физиологии микробов составили идеи В.Л. Омелянского, указывавшего на высокую точность и специфичность деятельности микроорганизмов. «Самые разнообразные реакции окисления и восстановления, гидратации и дегидратации, реакции разложения, полимеризации и атомных группировок, – писал Омелянский, – вызываются микроорганизмами с поразительной легкостью, приводя к глубоким изменениям подвергнутого их воздействию субстрата»[65].

Микробиологическую трансформацию используют главным образом для получения из стероидного сырья растительного происхождения веществ, обладающих фармацевтическими или гормональными свойствами. Поиски в природе микроорганизмов – трансформаторов стероидной молекулы, способных осуществлять тончайшие реакции (гидроксилирования, дегидрогенизации, дезацетилирования, восстановления и т. п.), ведут по двум направлениям: обнаружение в природе таксономических групп, способных производить ту или иную трансформацию, и выделение методами селекции наиболее активных штаммов. Так были найдены штаммы некоторых грибов, способные осуществлять трансформацию с выходом кортизона и гидрокортизона, актиномицеты и микобактерии, применяющиеся для получения преднизона, преднизолона, диакобала, культуры грибов и микобактерий, селективно дезацетилирующие стероидные соединения.

Исследования трансформирующей активности микроорганизмов основывались на углубленном изучении их физиологии и интенсификации нужных ферментативных процессов. Были найдены также коррелятивные связи между морфологическими свойствами и химической активностью и установлена возможность подбором соответствующих условий (например, окислительно‑восстановительных) и усилением нужной ферментативной активности микробов направлять процесс трансформации.