Развитие представлений о лизогении

Открытие лизогенных бактерий, способных подвергаться спонтанному лизису, привело к появлению гипотез о бактериальном происхождении фага. Д’Эрелль и другие сторонники вирусной природы фага отрицали существование лизогенных бактерий, считая, что они лишь загрязнены фагом. Однако вскоре были установлены факты, свидетельствующие о существовании лизогенных бактерий. В 1921 г. О. Байль обнаружил спонтанный лизис бактериальной культуры, ранее не проявлявшей признаков лизиса. Из единичных колоний Е. coli были выделены клоны, одни из которых продуцировали фаг, а другие не обладали этим свойством (О. Байль, 1925; Ж. Борде, 1925). Наконец, Е. Мак‑Кинли (1925) установил сохранение лизогенными бактериями способности образовывать фаг даже после продолжительного выращивания в присутствии антифаговой сыворотки. Это доказало независимость спонтанного лизиса от наличия в культуре фага.

Мысль об отсутствии противоречия между существованием лизогенных бактерий и вирусной природой фага впервые высказал Вернет (1929). Стойкое сохранение признака лизогенности в культурах лизогенных бактерий в условиях, исключающих существование свободного фага, а также установленный им факт отсутствия инфекционных частиц фага в разрушенных лизогенных клетках он объяснил тем, что в лизогенных клетках фаг находится в неинфекционной форме в виде зачатка, способного под действием невыясненных причин превращаться в фаг. Оставалась неясной природа «зачатка»: является ли он латентным вирусом или структурой, связанной с генетическим аппаратом клетки. Ответ на этот вопрос дали исследования голландца Л. Доорен де Ионга (1931), установившего, что споры лизогенной культуры Вас. megaterium сохраняют свойство лизогенности при 100°. Поскольку фаги инактивируются уже при 75°, Доорен де Ионг высказал мысль, что «зачаток» не может быть латентным вирусом и что фаг образуется в лизогенных бактериях de novo. Однако правильный вывод Доорен де Ионга был поставлен под сомнение в связи с выявлением терморезистентности обезвоженных фагов (А. Веддер, 1932).

Изучение лизогении послужило отправным пунктом для формирования гипотез о наследственной природе этого явления. Первая из них была высказана Ж. Борде[196] в 1923 г., который пришел к идее «инфекционной наследственности» лизогенных бактерий. Однако он не связывал с понятием наследственности определенные материальные структуры, а подразумевал под этим явлением «динамическое равновесие» протекающих в бактериях процессов.

Хромосомная теория наследственности нашла свое отражение в гипотезах О. Байля (1925) и особенно Е. Вольмана (1928). Развивая идеи Борде об инфекционной наследственности, Вольман впервые связывает лизогению с наличием материальных носителей «наследственных факторов», характеризующихся простотой организации и способных передаваться во внешней среде. Он постулирует наряду с хромосомным механизмом передачи наследственных факторов существование особого механизма их передачи – посредством окружающей клетку среды («инфекционная наследственность»). Гипотеза инфекционной наследственности, связавшая такие различные феномены, как наследственность и инфекция, привела в дальнейшем к концепции эписом. В 1933 г. супруги Е. и Е. Вольман высказали гипотезу, что фаг существует в двух формах – инфекционной и неинфекционной. По их мнению, при литической реакции происходит чередование инфекционной и неинфекционной фаз в цикле размножения фага. Они предполагали, что фаги в лизогенных бактериях образуются при каждом делении клетки из структур, их не содержащих. Сохранение способности образовывать фаг в лизогенных бактериях осуществляется, по мнению авторов, благодаря наследственному аппарату клетки.

Гипотеза чередования инфекционной и неинфекционной фаз в отношении лизогенных бактерий не подтвердилась, но она способствовала открытию неинфекционной фазы в цикле размножения фага. В 1938 г., американский биохимик Дж. Нортроп, прославившийся своими работами по получению протеолитических ферментов в кристаллической форме (Нобелевская премия, 1946), на основании произвольной аналогии между бактериофагом и ферментом желатиназой, секретируемым культурой лизогенной бактерии, высказал гипотезу, что фаги выделяются лизогенными бактериями в процессе их роста (гипотеза «секреции»). Эта гипотеза вследствие высокого научного авторитета Нортропа получила признание у большинства его современников.

Удобство экспериментов с фагами и такое же высокое содержание ДНК в их нуклеопротеиде, как и в хромосомах высших организмов (М. Шлезингер, 1936), вызвало огромный интерес к репродукции фагов как модели для выяснения природы гена. Именно удобство такой модели побудило физика‑теоретика М. Дельбрюка заняться в 1939 г. изучением вирусов бактерий.

С деятельностью Дельбрюка связан третий период в изучении фагов (1939–1953), который характеризуется формированием основ современного учения о вирусах бактерий. Этот период ознаменован фундаментальными исследованиями размножения фагов, их генетических свойств, морфологии частиц, раскрытием природы лизогении, разрешением противоречий между вирусной и генной теориями, а также открытием генетической роли ДНК фагов.

В 1939 г. М. Дельбрюк совместно с Э. Эллисом разработали метод изучения одиночного цикла размножения фагов, который лег в основу их современных количественных исследований. Применение этого метода позволило выявить в цикле размножения фага три этапа: адсорбцию фага бактерией, скрытый период и период лизиса («взрыва» клетки), сопровождающийся выделением нескольких десятков частиц фага. Было доказано, что обязательным условием высвобождения фага из бактериальной клетки является ее лизис. Но оставалось неясным, что происходит в зараженной бактериальной клетке в скрытый период.

Применение генетических методов дало возможность обнаружить рекомбинанты в потомстве фагов, полученном при заражении бактерий мутантами двух близкородственных фагов (М. Дельбрюк, В. Бейли, 1946; А. Херши, 1946)[197]. А. Дёрман установил, что после заражения клетки фаг переходит в неинфекционную форму, интенсивно размножаясь и давая рекомбинанты, которые он назвал вегетативным фагом.

Открытие рекомбинантов у фагов положило начало новому направлению – генетике фагов. Применение генетических методов позволило А. Херши и Р. Ротман (1948, 1949) построить первую генетическую карту фага Т2, представленную тремя группами сцепления.

Важное значение имело применение при исследовании фагов электронной микроскопии, меченых атомов и других методов микроанализа. Электронномикроскопические исследования (С. Луриа, Т. Андерсон, 1942) вскрыли сложное строение частицы фага Т2, состоящей из головки и отростка. Присоединение фага к поверхности клетки только отростком (Т. Андерсон, 1952) указывало на то, что он представляет собой структуру, обеспечивающую адсорбцию фага. О локализации ДНК в головке фага и ее значении свидетельствовали опыты по образованию «теней» – пустых белковых оболочек фага, освобожденных от ДНК осмотическим шоком (Р. Херриот, 1951) и способных убивать клетки хозяина беи размножения в них.

Роль белка и ДНК фага при инфицировании бактерий была установлена при помощи изотопов С¹⁴ и N¹⁵ А. Херши и М. Чейз (1952). Авторы выявили в механизме заражения бактерий фагом два основных принципа. Первым этапом размножения фага является освобождение его ДНК из белкового чехла, который в дальнейшем перестает функционировать. Одной ДНК достаточно, чтобы вызвать инфекцию. Тем самым было показано, что фаг как таковой не проникает в бактерию и что размножению фага дает начало не родительская частица, а ее ДНК.

Эта работа явилась вехой в развитии учения о вирусах бактерии. Она раскрыла функциональную роль компонентов частицы фагов, механизм заражения бактерий вирусом и убедительно доказала генетическую роль ДНК вирусов бактерий. Хотя значение ДНК как наследственного вещества было установлено еще в 1944 г. при изучении трансформирующего агента пневмококка, только эта работа привела к резкому изменению взглядов на природу гена. Она поставила также ряд важнейших вопросов, определивших последующее развитие вирусологии: каков механизм репликации ДНК вирусов бактерий, каким образом вирусная ДНК определяет синтез специфических вирусных белков?