Электронный микроскоп

Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. Максимально возможное разрешение равно половине длины волны используемого света. Получить изображение объекта размером меньше, чем эта величина, невозможно. Средняя длина волны видимого света составляет примерно 550 нм, поэтому в конце XIX в. могли получить разрешение примерно в 200 нм. Незначительное увеличение разрешающей способности было достигнуто благодаря использованию специально сконструированного микроскопа с ультрафиолетовым светом (длина волны которого составляет 250 нм), обеспечивающим разрешение примерно в 100 нм. Однако многие клеточные структуры имеют меньший размер. Эта проблема была решена в тридцатые - сороковые годы, когда создание электронного микроскопа произвело революцию в биологической науке. Вместо светового излучения в электронном микроскопе используют пучок электронов, у которых длина волны значительно меньше и, следовательно, с намного большей разрешающей способностью. Длина волны электронов зависит от напряжения, подаваемого для генерации электронного пучка, но практически можно получить разрешение приблизительно в 0,5 нм, т. е. примерно в 500 раз больше, чем в световом микроскопе. Создаваемое увеличение достаточно, чтобы различить крупные молекулы. Лимитирующим фактором в достижении большего увеличения стало (и остается до сих пор) не усиление разрешающей способности микроскопа, а методы подготовки материала для исследования.

В сущности принцип действия электронного микроскопа такой же, как и светового микроскопа, в котором пучок световых лучей направляется линзой конденсора через образец, а полученное изображение затем, увеличивается с помощью линз. В табл. П.2.4 суммированы некоторые сходства и различия между этими микроскопами. Запомните также, что принципы подготовки материала для электронной и световой микроскопии примерно одинаковы, хотя имеются и важные различия (табл. П.2.3).

Таблица П.2.4. Сравнение светового и электронного микроскопов

Оператор сидит у пульта управления лицом к колонне, по которой проходит пучок электронов (рис. П.2.5). Электронный микроскоп перевернут "вверх дном" по сравнению со световым микроскопом. Здесь источник электронов находится в верхней части колонны, а сам образец - внизу (рис. П.2.6). На вольфрамовую нить накала, находящуюся в верхней части колонны, подается высокое напряжение (например 50000 В), и нить накала излучает поток электронов. Чтобы сфокусировать эти электроны (изменить их траекторию), необходимы уже не стеклянные линзы, а электромагниты. Внутри колонны создается глубокий вакуум, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения с частицами воздуха и происходящее в результате этого нагревание.

Для подготовки материала к исследованию используют различные приемы (они описаны ниже), но в любом случае материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме, быстро нагревается и начинает разрушаться под действием пучка электронов. Фотографировать необходимо для регистрации информации в том случае, если требуется длительное изучение образца.

1. Окрашивание ультратонких срезов тяжелыми металлами.

2. Негативное контрастирование.

3. Напыление.

4. Замораживание - скалывание и замораживание - травление.

Рис. П.2.6. Траектория пучка электронов в трансмиссионном электронном микроскопе