Определение способности S. аurеus продуцировать бета-лактамазы

В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма - стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 ⁰С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 ⁰С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазы судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).

Метод серийных разведений. Методом серийных разведений МИК определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроба в пробирках или чашках с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика.Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10^{6 -} 10⁷ бактериальных клеток в 1 мл.

В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 ⁰С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Учетным признаком при этом является наличие/отсутствие мутности бульона в пробирках. В контроле культуры должна быть мутность, в остальных контролях — нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен) (табл. 1).

Таблица 1.Определение чувствительности бактериальной культуры к антибиотнку методом сернйных разведений

Другие методы. Промежуточное положение между двумя вышеописанными методами занимает метод определения чувствительности с помощью Е-тестов. Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4,..., мкг/мл). Е-тесты, как и диски при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде «газона». После инкубирования вокруг полоски формируется элипсовидная зона задержки роста, которая сужается в области малых концентраций и «пересекает» полоску на уровне, соответствующем величине МИК (рис. 2).

Рисунок 2 Е-тест. МИК антибиотика: а — 0,5 мкг/мл; 5—64 мкг/мл

При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам. Это позволяет упростить и ускорить проведение исследования, а также снизить его стоимость. Наиболее часто применяют методы серийных разведений в планшетах и пограничных концентраций (микрометоды). В первом случае, как правило, используют готовые стерильные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых внесены и лиофильно высушены убывающие концентрации антибиотиков в бульоне. После вскрытия планшета стандартизованную суспензию испытуемой культуры в одинаковой (например, 0,1 мл) асептически вносят в соответствующие ряды лунок, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной температуре. Среда при этом восстанавливается, что позволяет после инкубирования планшета отметить рост (помутнение бульона) в тех лунках, где антибиотик не действует. При помутнении бульона в контроле культуры и опытных лунках определяют величину МИК. Учет можно вести как визуально, так и с помощью специальных микробиологических анализаторов. В этих приборах имеется возможность автоматизации основных действий: внесения культуры, инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности (степени мутности) жидкости в каждой лунке, графическое отображение результатов (в том числе в динамике), определение степени чувствительности и печать протокола исследования.

Метод пограничных концентраций можно считать усеченным методом серийных разведений. В соответствии с ним испытуемую культуру вносят только в две лунки (пробирки), где находятся высокая (С) и низкая (с) концентрации антибиотика. Концентрация С соответствует границе между устойчивыми и умеренно устойчивыми штаммами, а концентрация с — границе между умеренно устойчивыми и чувствительными штаммами. Если после нкубирования рост отсутствует в обеих лунках, штамм относят к чувствительным, если только в лунке с концентрацией С— к умеренно устойчивыми штаммам, а если в обеих лунках имеется рост, штамм относят к устойчивым.

Важные условия корректного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам: использование только чистых культур и соблюдение правил асептики; применение стандартных питательных сред, соответствующих питательным потребностям испытуемого микроорганизма (среда Мюллера —Хинтона, агар АГВ, среда НТМ и др.); внесение испытуемой культуры в стандартной дозе и соблюдение установленного соотношения инокулюм/среда; правильный режим инкубирования и метод учета. Учитывая то, что признак подвержен фенотипическим и генотипическим изменениям, чувствительность к антибиотикам желательно проверять у свежевыделенных культур, выделенных из материала до начала антибиотикотерапии, и повторять исследование с культурами, выделенными в ходе лечения.

В последние годы в практике стали применять ПЦР для выявления у микробов специфических генов, ответственных за формирование лекарственной устойчивости (геноиндикация антибиотикоустойчивых культур).