Получение антисыворотки

Для получения системы определения гормона высокоочищен­ный гормон вводят лабораторным животным, индуцируя у них синтез иммуноглобулинов, обладающих достаточно высокой специ­фичностью и чувствительностью, чтобы их можно было использо­вать для радиоиммунологических определений. Как правило, со­единения с размерами молекул менее 1000 дальтон недостаточно иммуногенны и для придания им свойств активных нммуногенов их нужно соединять с молекулой-носителем. Иммуногеном назы­вается вещество, способное индуцировать образование антител. Для того чтобы обеспечить возможность индукции антителообразо­вания, небольшие молекулы, или гаптены, можно соединять с та­кими веществами, как альбумин, тироглобулин или гемоцианин. Иммуногенная реакция обычно выше в случае введения тех бел­ков-носителей, которые и сами являются высокоиммуногенными. В связи с этим такие вещества, как альбумин, тироглобулин и ге­моцианин являются более подходящими белками-носителями, чем полилизин или другие синтетические полиаминокислоты, при ин­дукции синтеза специфических антител к конъюгированным гаптенам. Стероиды, тиреоидные гормоны (трийодтиронин и тироксин) и различные формы витамина D, как правило, требуют конъюга­ции с белками-носителями. Необходимо тщательно следить за тем, чтобы в процессе конъюгации стероидов и других гаптенов прини­мала участие та часть молекулы, изменение которой в наименьшей мере сказывалось бы на стереоспецифичности этой молекулы. На­пример, антитела к 17 b-эстрадиолу лучше всего образуются при ковалентном присоединении его 6-кетоаналога к альбумину, т. е. при сохранении интактности 3- и 17-гидроксильных групп, равно как и кольца А, стероида. Последнее особенно важно, поскольку именно эти структуры придают данному эстрогену специфичность.

За многие годы разработаны разнообразные методики иммуни­зации, но все они, по существу, являются модификациями ориги­нальной методики Фрейнда [34]. Эмульсия, содержащая гормон, или иммуноген, соответствующее масло и убитые нагреванием ту­беркулезные палочки, вводят внутри- или подкожно. С получе­нием высокоочищенных гормонов и других производных удалось разработать методику иммунизации малыми количествами имму­ногена [35]. Имеются надежные экспериментальные доказательст­ва образования специфических обладающих высоким сродством антител к малым дозам иммуногена [36]. Именно малые дозы иммуногена с наибольшей вероятностью обусловливают продук­цию специфических иммуноглобулинов теми клетками, которые образуют антитела с наиболее высоким сродством к иммуногену. В связи с этим при применении больших доз иммуногена повыша­ется вероятность выработки антител, обладающих низким сродст­вом. При введении очень больших доз иммуногена у иммунизиро­ванных животных может наблюдаться феномен толерантности, когда антитела вообще не образуются или образуются в очень низких титрах [37, 38]. После начальной иммунизации обычно дол­жно пройти минимум 6 нед, чтобы появились значительные титры антител. Сродство антител продолжает увеличиваться и достигает максимума обычно между 8-й и 12-й неделей после начальной иммунизации [35, 39]. Эмпирически установлено, что повторная иммунизация животного обеспечивает лучшую реакцию в том слу­чает, если повторные инъекции производят в период снижения титра циркулирующих антител. При повторном введении 1/2 или 1/4 дозы гормона, использованной при первичной иммунизации, значительное повышение титра циркулирующих антител наблюдается уже через несколько дней. Повторную иммунизацию животного следует производить в ту же анатомическую область, в кото­рую иммуноген вводили первый раз. Больше того, для воспроизве­дения реакции «по памяти» уже не нужно вводить убитые нагре­ванием туберкулезные бациллы, которые могут увеличивать забо­леваемость и смертность животных.

Для получения специфических антител следует выбирать те виды животных, которые легко доступны, не слишком дороги и у которых структура своего собственного эндогенного гормона зна­чительно отличается от применяемого для иммунизации. Напри­мер, хотя СТГ у животных разных видов обладают одинаковой биологической активностью, но они существенно различаются по аминокислотному составу. Эти различия в первичной структуре, как и некоторые другие недостаточно охарактеризованные факто­ры определяют иммуногенность гормона для других видов живот­ных. В некоторых случаях аминокислотные последовательности могут различаться относительно слабо и поэтому нужно с особой тщательностью подбирать вид животного, которому вводят гормон. Например, структура инсулина у человека, кролика и овцы почти одинакова, но инсулины человека и морской свинки различаются сильнее. Для получения специфических антител к инсулину чело­века лучше всего использовать именно морских свинок [40].