Избыточность и обратные связи в работе шпемановского организатора

Главная функция организатора Шпемана состоит в создании стабильной дорзовентральной (спинно‑брюшной) разметки эмбриона. Там, где концентрация активных белков из группы BMP (bone morphogenetic proteins) минимальна, клетки наружного слоя зародыша превращаются в нервные. Формируется нервная пластинка – зачаток центральной нервной системы. Там будет спинная сторона. Нервная пластинка в свою очередь индуцирует развитие других органов и структур. Остальные клетки наружного слоя под действием морфогенов BMP – а их больше на будущей брюшной стороне зародыша – становятся клетками эпителия. Спинной (шпемановский) организатор производит белок‑морфоген хордин, который блокирует действие BMP. Там, где много хордина, мало активных молекул BMP, в результате в этой области зародыша формируется спина.

Казалось бы, вот и хорошо: система из двух взаимодействующих морфогенов, BMP и chordin, вполне достаточна для дорзовентральной разметки зародыша. Какие‑то дополнительные ухищрения здесь, наверное, не нужны. Не тут‑то было!

Как выяснилось, помимо основного регуляторного взаимодействия «хордин блокирует BMP» в создании дорзовентральной полярности у позвоночных участвует целый ряд морфогенов и связей между ними. Спинной организатор «общается» с брюшным организующим центром посредством белков‑морфогенов, выделяемых в межклеточное пространство. Все эти морфогены тем или иным способом влияют на дорзовентральный градиент BMP, усиливая или ослабляя его. Отрицательные обратные связи, которыми изобилует эта регуляторная сеть, делают градиент BMP устойчивым к разнообразным помехам и нарушениям. Например, если производство BMP по какой‑то причине увеличивается, это приводит к росту экспресии белка Sizzled, который подавляет активность белка Tolloid, который в свою очередь выводит из строя хордин, инактивирующий BMP (см. рисунок ниже). Получается типичный регуляторный контур, основанный на отрицательной обратной связи: больше BMP → больше Sizzled → меньше Tolloid → больше Chordin → меньше BMP.

Благодаря наличию нескольких таких контуров градиент BMP оказывается на редкость устойчивым. Генно‑инженерные эксперименты показали, что для того, чтобы серьезно нарушить этот градиент – и получить, например, полностью «дорзализованный» эмбрион, у которого весь наружный слой клеток превращается в нервную ткань, или полностью «вентрализованный» эмбрион вообще без нервной пластинки, – недостаточно вывести из строя какой‑то ключевой ген‑регулятор. Даже без хордина, даже без BMP4 дорзовентральный градиент все равно худо‑бедно формируется за счет дополнительных регуляторных контуров и морфогенов‑«дублеров». Нужно выключить сразу 3–4 гена, чтобы нарушения развития стали действительно катастрофическими (De Robertis, 2009). Вот что значит настоящая помехоустойчивость!

Разумеется, естественный отбор не стал бы создавать столь поразительный запас прочности только на случай прихода любопытных биологов, которые начнут отключать в эмбрионах гены. В природе и без нас хватает неприятных неожиданностей: перемены климата и химического состава среды, мутации, неудачные комбинации родительских генов… Все это может нарушить работу тех или иных генных систем. Поэтому в общем случае генотипы, обеспечивающие более помехоустойчивое развитие, получают преимущество над генотипами, срабатывающими только в тепличных условиях. Ну а если жизнь становится более предсказуемой – как, например, у внутриклеточных паразитов – может произойти редукция стабилизирующих систем и упрощение генетической программы развития.

–––––

 

Изменения регуляторных участков генов – регуляторов развития играют важнейшую роль в эволюции многоклеточных. С несколькими примерами мы познакомились в главе 5. Но до сих пор мы исходили из негласной презумпции однозначного соответствия между генотипом и фенотипом: изменился геном – изменился признак.

Пора внести важное уточнение. Мы должны помнить, что само это соответствие не с неба падает. По умолчанию оно вовсе не однозначно, а для того, чтобы оно стало таковым, необходимы специальные стабилизирующие адаптации, которые должны постепенно развиваться в ходе эволюции.

Это согласуется с идеей о творческой роли стабилизирующего отбора, которую развивал великий советский биолог И. И. Шмальгаузен (1884–1963). Отбор на стабильность должен вести к усложнению программы развития. Отбор, просто отсеивающий уродцев (отклонения от «нормы», т. е. от оптимального в данных условиях фенотипа), в перспективе способствует развитию новых генно‑регуляторных контуров, повышающих стабильность воспроизведения «нормального» фенотипа.

 

 

Регуляторная сеть, обеспечивающая дорзовентральную (спиннобрюшную) разметку эмбриона шпорцевой лягушки Xenopus. Из De Robertis, 2009.

 

Генотип определяет не фенотип как таковой, а норму реакции, т. е. диапазон возможных фенотипов, которые могут быть реализованы при данном генотипе. «Выбор» конкретного фенотипа часто зависит от условий, в которых происходит развитие. Но даже генетически идентичные особи, развивающиеся в одинаковых условиях, все равно будут хоть немного, но разными. И чем хуже у них работают стабилизирующие генно‑регуляторные контуры, тем сильнее будет случайная вариабельность.

Наличие стохастической составляющей в генетической программе развития ярко проявляется в неполной пенетрантности многих мутаций. Суть этого явления, замеченного еще в 1925 году выдающимися генетиками Н. В. Тимофеевым‑Ресовским (1900–1981) и Д. Д. Ромашовым (1899–1963), состоит в том, что одна и та же мутация у одних особей проявляется в фенотипе, а у других нет. Это зависит от условий среды и «генетического контекста», т. е. от других генов в геноме (что неудивительно), но даже с поправкой на оба эти фактора многие мутации все равно имеют нестабильный фенотипический эффект.

О молекулярных механизмах неполной пенетрантности известно немного. Их изучение осложняется тем, что генные сети, управляющие развитием, обычно крайне громоздки и на первый взгляд избыточны. Входящие в их состав гены связаны сложнейшей сетью взаимодействий, содержащей многочисленные петли положительных и отрицательных обратных связей, так что трудно понять, где именно в этой паутине возникает непредсказуемость.

Идеальный объект для таких исследований – наш старый знакомец червь Caenorhabditis elegans, у которого генетическая регуляция развития предельно упрощена, как, впрочем, и само развитие[95].

Биологам из Массачусетского технологического института и Принстонского университета (США) удалось выяснить причины неполной пенетрантности нескольких мутаций гена skn‑1 (Raj et al., 2010). Эти мутации приводят (или не приводят, так как пенетрантность неполная) к тому, что потомки бластомера (зародышевой клетки) E, которые должны стать клетками кишечника, остаются недифференцированными, и кишечник у эмбриона не формируется.

Роль главного «переключателя» в развитии кишечника играет ген elt‑2. Он активирует сотни других генов, необходимых для превращения бластомеров в кишечные клетки. Чтобы сам elt‑2 своевременно включился, требуется работа генов end‑3 и end‑1. Они в свою очередь активируются геном skn‑1, причем активация осуществляется как напрямую, так и опосредованно, через ген med‑1/2.

Известно несколько мутаций гена skn‑1, нарушающих развитие кишечных клеток. Все эти мутации в гомозиготном состоянии летальны, и в этом смысле пенетрантность у них стопроцентная. Однако у некоторых мутантных эмбрионов перед смертью формируется нормальный кишечник, а у других – нет. В этом отношении пенетрантность неполная.

Чтобы выяснить причины неполной пенетрантности, авторы воспользовались новым методом флюоресцентной окраски молекул РНК, который они сами и изобрели. Метод позволяет увидеть и даже подсчитать молекулы матричной РНК (мРНК), считанные с определенного гена. Каждая отдельная молекула мРНК становится видна как светящаяся точка. Это дает уникальную возможность определять уровень активности гена в индивидуальных клетках.

Оказалось, что у эмбрионов с мутантным геном skn‑1 в клетках, которые должны стать кишечником, med‑1/2 не включается вовсе, а end‑3 работает очень слабо. Что касается гена end‑1, то его активность становится непредсказуемой. В норме этот ген на определенной стадии развития эмбриона начинает работать в клетках, которые должны стать кишечником, причем уровень его активности во всех этих клетках примерно одинаков. У мутантных эмбрионов end‑1 начинает работать в разных клетках с разной силой, а в некоторых не включается вовсе, так что общая картина получается хаотичной.

 

 

«Родословная» клеток кишечника в развитии эмбриона C. elegans. Кишечник взрослого червя состоит из 20 клеток. Все они являются потомками бластомера E, который происходит от бластомера EMS, а тот – от P1. Бластомер P1 образуется в результате первого деления оплодотворенной яйцеклетки (P0). «Братом» бластомера EMS является бластомер P2 – организатор, формирующий передне‑заднюю полярность зародыша при помощи морфогена Wnt. Из Raj et al., 2010.

 

Этот хаос на следующем этапе регуляторного каскада приводит к одному из двух альтернативных результатов: либо ген elt‑2 включается, и тогда клетки превращаются в кишечник, либо elt‑2 остается выключенным, и тогда кишечник не формируется. Как выяснилось, выбор одного из двух исходов зависит от того, достигнет ли активность end‑1 определенного порогового уровня. Однако и тут сохраняется доля неопределенности. Если активность end‑1 ниже пороговой, elt‑2 точно не включится и кишечника не будет. Если же активность end‑1 выше пороговой, то это еще не гарантирует включения elt‑2: он либо включится, либо нет. Раз включившись, elt‑2 уже будет работать нормально сколько ему положено, потому что этот ген активирует сам себя.

Хаос, возникающий в работе гена end‑1, объясняется отсутствием должной регуляции со стороны end‑3. Если вывести из строя end‑3, то результаты получаются примерно такие же, как и при мутациях skn‑1, т. е. ген end‑1 начинает работать хаотично, а ген elt‑2 либо включается, либо нет. Если же вывести из строя end‑1, то при нормально работающих skn‑1 и end‑3 никакой неполной пенетрантности не возникает и кишечник формируется у всех эмбрионов.

 

 

Регуляторный каскад, приводящий к включению гена elt‑2 в клетках будущего кишечника. Ген skn‑1 (точнее, белковый продукт этого гена) активирует гены med‑1/2, end‑3 и end‑1. Два последних гена активируют ген elt‑2, который включает сразу сотни генов, необходимых для превращения бластомеров в клетки кишечника. Несмотря на крайнюю простоту этого регуляторного каскада (по сравнению с тем, что наблюдается у других животных), в нем много «избыточности»: активация одного и того же гена осуществляется не одним, а несколькими параллельными путями. Из Raj et al., 2010.

 

Таким образом, в норме elt‑2 включается благодаря согласованному действию двух регуляторов: end‑3 и end‑1, причем эти регуляторы отчасти взаимозаменимы. Если выйдет из строя end‑1, то нормально работающий end‑3 справится с задачей самостоятельно и включит elt‑2 в положенное время. Если же забарахлит end‑3, то работа end‑1 дестабилизируется, но все же он сумеет включить elt‑2 хотя бы у некоторых эмбрионов.

Подобные факты указывают на то, что кажущаяся «избыточность», характерная для большинства генно‑регуляторных каскадов, управляющих развитием эмбриона, обеспечивает стабильность (помехоустойчивость) развития. Благодаря этой избыточности выход из строя отдельных регуляторов (в результате мутаций или неблагоприятных условий среды) может быть скомпенсирован оставшимися элементами регуляторного каскада по крайней мере у некоторых зародышей. «Случайный шум», который может при этом возникнуть в работе каскада, позволяет одним зародышам развиваться нормально, в то время как другие зародыши с точно таким же геномом могут приобрести какие‑то новые фенотипические признаки. Скорее всего, это будут несовместимые с жизнью уродства, но вероятность появления полезных отклонений тоже ненулевая. В таком случае естественный отбор в дальнейшем будет закреплять у потомков этих «перспективных уродов» такие мутации, которые сделают новый путь развития более стабильным. В итоге этот новый путь окажется вписан в геном и станет вполне наследственным.

 

–––––