Ингредиенты 2000-летнего лекарственного препарата раскрыты в результате химических, минералогических и ботанических исследований

Жанна Джаки^а, Паскино Паллекки^а, Антонелла Ромуальди^а, Эрика Рибечини^b, Жанетт Жаклин Лучейко^b, Мария Перла Коломбини^b и Марта Мариотти Липпи^c.

^a Soprintendenza per i Beni Archeologici della Toscana, 50143 Florence, Italy;

^b Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale, Università di Pisa, 56126 Pisa, Italy;

^c Dipartimento di Biologia Evoluzionistica, Università di Firenze, 50121 Florence, Italy

 

В археологии открытие древних лекарств очень редко, так же как и понимание их химического состава. В этой статье мы представляем результаты, объединяющие химические, минералогические и ботанические исследования хорошо сохранившегося содержимого оловянной баночки-пиксиды (pyxis), обнаруженной на борту корабля, потерпевшего крушение в Поццино (Pozzino) (второй век до н.э.). Содержимое состоит из шести плоских серых таблеток в виде дисков, которые являются прямым доказательством древнего лекарственного препарата. Полученные данные раскрывают интересную информацию о составе таблеток и об их возможном терапевтическом применении. Гидроцинкит[1] и смитсонит[2] были наиболее распространенными ингредиентами таблеток Pozzino, наряду с крахмалом, животными и растительными жирами и сосновой смолой. Состав и форма таблеток Pozzino, кажется, указывают на то, что они использовались в офтальмологических целях: латинское название collyrium (средство для промывания глаз) происходит от греческого названия κoλλυ´ρα, что означает «маленькие круглые хлебцы». Это исследование дало ценную информацию о древней медицинской и фармацевтической практике и о развитии фармакологии и медицины на протяжении веков. Кроме того, учитывая современный фокус на природные компоненты, наши данные могут привести к новым открытиям и исследованиям в области медицинской помощи.

 

Археометрия | археоботаника | химический анализ | минералогический анализ | Этрусские кораблекрушения

 

В археологии открытие древних лекарств очень редко, так же как и понимание их химического состава (1–3). Большая часть информации о таких находках поступает от древних авторов, таких как Теофраст (371–286 гг. до н.э.), Плиний Старший (I век н.э.) и Диоскорид (I век н.э.).

Мы представляем результаты, объединяющие химические, минералогические и ботанические исследования, хорошо сохранившегося содержимого оловянной пиксиды. Эта пиксида была обнаружена на борту затонувшего судна Pozzino, обнаруженного на дне залива Баратти (рис. S1) на глубине около 18 м вблизи остатков этрусского города Популония (Populonia) (Тоскана, Пьомбино, Италия) (4-6).

Затонувший корабль был обнаружен в 1974 году, и Управление археологического наследия Тосканы в 1982 году провело первые исследования, а в 1989–1990 годах – археологические раскопки. Корабль имел небольшой корпус (длиной 15–18 м и шириной около 3 м), сохранившийся только в центральной части и наклоненный в направлении восток-запад, с кормой, вероятно, обращенной на запад. На основании археологических находок он был датирован второй половиной II века до нашей эры (вероятно, 140–130 гг. до н. э.).

В то время Популония имела важное значение на торговых путях между Востоком и Западом, и это кораблекрушение свидетельствует о торговли Республики через Средиземное море. Во время раскопок было найдено много интересных предметов, среди них сложенные сирийско-палестинские стеклянные чаши; посуда West slope из Пергама; некоторые лагины; Rhodian amphora для транспортировки вина; лампы Эфесского происхождения; несколько оловянных и бронзовых сосудов, таких как сосуды с одной ручкой (один с фильтрующим носиком); Ойнохойя (oinochoai) с трилистниковым венчиком; ковши; и одна чернильница, все из той же географической области. Такие объекты предполагают, что судно или, по крайней мере, большая часть его груза прибыло с востока, вероятно, с греческого побережья или островов. Вполне вероятно, что судно был экипировано в свободной гавани острова Делос (4,5). В груз также входило медицинское оборудование: многочисленные оловянные пиксиды и 136 деревянных флаконов, которые были найдены рядом с замком от деревянного ящика, который был утерян. Маленькие цилиндрические пузырьки были сделаны из самшита (Buxus sempervirens L.). Они были высотой 5–6 см и диаметром около 2 см. Большинство из них были оснащены собственными крышками, часто короткими и конусообразными. Эти предметы первоначально, вероятно, хранились внутри ящика вместе с небольшой чашей Mortarium [3], бронзовым сосудом (cupping vessel) и железным зондом (4,5). Сосуд (cupping vessel) имел своеобразную форму, типичную для медицинской посуды, используемой для кровопускания или в качестве сосуда для подачи горячего воздуха для успокоения боли (4,5). Эти находки свидетельствуют о том, что врач путешествовал по морю со своим профессиональным оборудованием.

Рентгеновское излучение выявило равномерно расслоенное содержимое внутри одной из оловянных пиксид (А/6) (рис. 1). Внутри баночки было пять дисковидных таблеток. Они были серыми, округлыми и имели диаметр 4 см, с максимальной толщиной 1 см. (рис. 2a и b). Тщательный осмотр одной из таблеток показал отпечаток на ее поверхности, оставленный под давлением какой-то ткани (рис. 2c).

 

Рис. 1. Пиксида (pyxis) A/6 перед тем, как была открыта (A), и содержимое пиксиды (pyxis) (B).

 

Рис. 2. (a) Передняя часть и (b) боковая часть таблетки, обнаруженной в пиксиде (pyxis) A/6. (c) Отпечаток на поверхности таблетки, оставленный какой-то тканью

 

Результаты

    Чтобы исследовать состав таблеток были отобраны некоторые фрагменты сломанной таблетки, которые были поделены на части для анализа. После предварительного микроморфологического исследования с помощью светового микроскопа (LM) и сканирующего электронного микроскопа (SEM) было проведено определение неорганических и органических компонентов с помощью химического и минералогического анализа образцов [сканирующий электронный микроскоп в сочетании с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии[4] (SEM-EDX), Фурье-спектроскопия[5] (FTIR), порошковая рентгеновская дифракция[6] (XRD) и газовая хроматография / масс-спектрометрия (GC/MS)]. Кроме того, для выявления наличия растительных остатков и их возможного происхождения был использован ботанический анализ.

Анализ SEM-EDX установил, что цинк являлся основным элементом (75%), наряду с кремнием (9%) и железом (5%) в качестве второстепенных неорганических элементов. FTIR и XRD выявили наличие гидроцинкита [гидроксикарбонат цинка, Zn₅(CO₃)₂(OH)₆], смитсонита (карбоната цинка, ZnCO₃), и гематита (Fе₂O₃). В частности, в спектре FTIR (рис. S2) гидроцинкит был распознан по пикам при 3377 (O-H колебания), 1560, 1510, 1385 (асимметричное колебание CO₃^2- ν3), 832 (изгиб OCO вне плоскости). ν2) и 708 см⁻¹ (асимметричный изгиб в плоскости OCO ν4) и смитсонит по пикам при 1424 (асимметричное колебание CO₃^2- ν3), 867 (изгиб вне плоскости OCO ν2) и 738 см⁻¹ асимметричный в плоскости OCO ν4). Неорганические компоненты составляли более 80% от общего количества, что было определено гравиметрическим методом части таблетки, растворенной в 10% водном растворе HCl.

FTIR-анализ органических компонентов показал наличие крахмала (рис. 3), идентификация которого была основана на пиках 3433, 2956–2851, 1630, 1460–1378 и 1154–1019 см^–1 связанный с колебаниями O–Η, C–H, изгибом O–Н и C–H и колебанием C–O соответственно. Этот результат был экспериментально подтвержден с помощью FTIR-анализа пшеничной муки, сначала прокипяченной в воде, а затем высушенной. GC/MS анализ растворимых и омыляемых органических компонентов (рис. 4) выявил смесь ацильных липидов растительного и животного происхождения и пчелиного воска (7,8).

Наличие пчелиного воска четко подтверждается высоким содержанием пальмитиновой кислоты (C16:0), а также присутствием длинноцепочечных n- спиртов, содержащих 24–32 атома углерода, линейных насыщенных монокарбоновых жирных кислот, содержащих 20–28 атомов углерода, и 14-гидроксигексадекановой и 15-гидроксигексадекановой кислот. Присутствие линейных и разветвленных монокарбоновых жирных кислот с 15-ю и 17-ю атомами углерода, а также холестерина и холестанола предполагает наличие ацильных липидов животного происхождения. Кроме того, благодаря идентификации β-ситостерина и высокому содержанию олеиновой кислоты, можно предположить, что липиды растительного происхождения были смешаны с пчелиным воском и ацильными липидами животного происхождения. Идентификация дегидроабиетиновой и 7-оксодегидроабиетиновой кислот указывает на присутствие смолы сосновых деревьев (7–9). Кроме того, некоторые фенантрены были обнаружены в очень небольших количествах, что подтверждает присутствие древесного угля, что также наблюдается с помощью SEM.

 

Рис. 3. Фурье-спектр (a) органических компонентов таблетки Pozzino (черная линия) в сравнении со спектрами (серые линии), полученными соответственно из (b) пшеничной муки, прокипяченной в воде и высушенной, и (c) спектром эталонного крахмала

 

Рис. 4. Хроматограмма полного ионного тока (TIC) триметилсилилированных гидролизуемых и растворимых компонентов, полученных методом GC/MS. 7ODA, 7-оксо-дидегидроабиетиновая кислота; AX - монокарбоновые жирные кислоты с длиной цепи х; AXbr - разветвленные монокарбоновые жирные кислоты с длиной цепи х; AX:Y - монокарбоновые жирные кислоты с длиной цепи x и степенью ненасыщенности y; DA, дегидроабиетиновая кислота; diAX, α, ω-дикарбоновые жирные кислоты с длиной цепи х; IS, внутренний стандарт n-тридекановой кислоты; OHx, n-алканолы с длиной цепи х; XOHAX, гидрокси жирные кислоты с длиной цепи х и с гидроксигруппой в положении X.

 

Многочисленные растительные включения были обнаружены в таблетке с помощью сканирующего электронного микроскопа и светового микроскопа (SEM и LM) (рис. 5), включая волокна, крахмальные зерна и пыльцевые зерна. Волокна были более многочисленными во внешних, чем во внутренних частях образца. Эти волокна могут быть волокнами от льна (Linum), которые были сломаны или разрезаны (рис. 5 a и b).

 

Рис. 5. Растительные включения. (a) Волокно льна (LM). (b) Волокно льна (SEM). (c) Крахмальное зерно (окрашивание Люголем, LM). (d) То же зерно крахмала при поляризованном свете в LM. (e и f) Крахмальное зерно в LM и при поляризованном свете в LM. (G и H) Пыльцевое зерно оливы европейской (Olea europaea) (LM: optical cross-section and exine surface focus). (i) Группа зерен пыльцы (LM).

 

В образце также были обнаружены крахмальные зерна разных размеров и форм. Концентрация хорошо сохранившихся зерен составляла ~ 20000 на грамм. Крупные зерна крахмала размером 20–25 мкм имели круглый - полукруглый контур сверху и линзовидный контур по бокам (рис. 5 c – f). У них были очевидные рубчики (hilum), радиально-симметричный extinction cross, с рукавами, иногда расширенными к концам, и едва видимыми пластинками; на поверхности иногда обнаруживались небольшие ямочки. Эти особенности позволяют предположить, что это были крупные зерна крахмала зерновых рода пшеницевых (Triticeae), возможно, пшеница (Triticum). Некоторые крупные зерна (максимальная длина ≥27 мкм) отображались слабые или утраченные extinction crosses, чешуйки и рубчики (рис. 5е). Этот вид повреждения считается маркером приготовления пищи (10) и может указывать на варку или выпекание в течение короткого периода времени.

Зерна пыльцы были многочисленными, с концентрацией 1400 зерен на грамм. Было найдено не менее 53 различных морфотипов пыльцы. Более 40% всего содержания пыльцы было от оливы европейской (Olea europaea) (рис. 5 g и h). Второй вид зерен по количеству, около 13%, принадлежал семейству злаковых (Gramineae) овсяно-пшеничной группе (Avena-Triticum). Исходя из морфометрических параметров и особенностей экзина (exine), они, вероятно, принадлежали пшенице (Triticum) (11, 12). Также в значительных количествах присутствовали пыльцевые зерна Маревых (Chenopodiaceae) (5%) и василька черного(Centaurea nigra) (3,5%). Они встречались поодиночке или группами и плохо сохранились.

Пыльца многих других растений, таких как: кровохлёбка малая (Sanguisorba minor), крапива двудомная (Urtica dioica), ольха чёрная (Alnus glutinosa) и крестоцветные (Cruciferae), которые могли использоваться в древней медицине, как сообщали древние авторы (13), были обнаружены во внутренней части таблетки, с 0,5 до 3% от общего количества пыльцевых зерен. Интересно, что за исключением оливы (Olea) и зерновых (Gramineae), у которых пыльца, возможно, имела различное происхождение, большинство зерен (около 60%) происходило от опыленных насекомыми растений, в частности Мотыльковые (Leguminosae) и Сложноцветные (Compositae). Это говорит о том, что такие зерна могли происходить из общего источника, такого как продукты пчеловодства, а не из ингредиентов, специально и намеренно добавленных в лекарство. Это также подтверждается наличием скоплений пыльцы, каждая из которых состоит из зерен, принадлежащих разным цветам, которые обычно предпочитают пчелы (рис. 5i).

Обсуждение и выводы

Гидроцинкит и смитсонит, безусловно, наиболее распространенные ингредиенты таблетки Pozzino. Хотя активный ингредиент не обязательно является наиболее распространенным, эффективность соединений цинка в лечении заболеваний человека, известная с древних времен, позволяет предположить, что карбонат и гидроксикарбонат цинка были активными соединениями в составе лекарственного средства Pozzino. Трудно сказать, какие соединения цинка использовались во время, когда были изготовлены таблетки Pozzino. Минералы цинка обычно называли «calamina», название, обозначающее различные комбинации силикатов / карбонатов / оксидов, которые можно найти в природе, вместе с рудами других металлов, таких как свинец, медь, железо и серебро (14). В терапии большое значение предавалось оксиду цинка, который был искусственно получен при плавлении меди из минералов, также содержащих цинковые руды. Плиний Старший в Naturalis Historia (15, стр.22) и Диоскорид в De materia medica (16, стр.732) описали различные качества cadmia [7], собранного со сводов или стенок печей во время плавления меди. Они написали, как этот побочный продукт был полезен для приготовления лекарств для глаз и для дерматологических целей.

Волокна льна, найденные в таблетках Pozzino, не были обнаружены в других древних лекарствах. Растительные волокна могли быть добавлены для предотвращения разрушения таблеток. Другие растительные включения в таблетке Pozzino содержали небольшие частицы древесного угли. Они могли быть продуктом обработки некоторых ингредиентов или были добавлены намеренно. На самом деле, черный уголь был найден в collyrii [8] из Лиона; однако его роль в качестве активного ингредиента не была установлена (17). В таблетке Pozzino были обнаружены зерна крахмала, вероятно, подвергнутые тепловой обработке. Крахмал с хорошо сохранившимися спиральными фрагментами (амилоза) был обнаружен в качестве ингредиента римской косметики, датируемой вторым веком нашей эры (18).

Также были обнаружены животные и растительные липиды. Что касается растительных липидов, которые могли быть добавлены к препарату, вполне вероятно применение оливкового масла. В прошлом oleum acerbum или «omphacium», полученное прессованием незрелых оливок, специально использовался в парфюмерии и для изготовления лекарственных препаратов (19, стр.60; 20, стр.145). Поверхность незрелых оливок могла быть загрязнена оливковой пыльцой, которая была обнаружена в значительных количествах.

В древние времена растительные смолы играли заметную роль благодаря их свойствам. В случае таблетки Pozzino сосновая смола, возможно, замедляла естественную деградацию (прогорклость) масла из-за его антиоксидантных свойств, а также могло снизить рост микроорганизмов из-за своих антисептических свойств.

Наконец, греческое имя κoλλυ´ρα, от которого происходит латинское название collyrium (17), означает «маленькие круглые хлебцы», подчеркивая, что сама форма таблеток Pozzino соответствует применению в офтальмологии.

Методы

Для характеристики компонентов таблеток скальпелем были отобраны образцы из раскрошившейся таблетки, которые были разделены и хранились в стеклянных сосудах до проведения лабораторных исследований. После предварительного микроморфологического исследования образцы были подвергнуты химическому и минералогическому анализу для выявления неорганических и органических компонентов и ботаническому анализу для выявления наличия растительных включений.

Анализ неорганических компонентов был выполнен с помощью SEM-EDX и FTIR-спектроскопии, тогда как минералогические фазы исследования были проведены с помощью XRD (процедура анализа и параметры инструментов приведены в ссылке 21). Содержание органических веществ было исследовано с помощью FTIR (22) наряду с анализом, основанном на GC/MS (процедура анализа и параметры инструментов приведены в ссылке 23).

В дополнение к наблюдениям под микроскопом и SEM были проведены археоботанические анализы на ~ 1 г таблетки. Чтобы учесть возможность загрязнения поверхности пыльцой, был отобран образец весом примерно 0,5 г из внутренней части таблетки и обработано для анализа пыльцы; другой образец 0,5 г был взят из внешней части таблетки, подвергшийся анализу на крахмал и пыльцу. Каждый образец сначала растворяли в 10% водном растворе HCl, который растворял основные компоненты таблетки, и промывали в воде.

Чтобы исследовать включения растений, в частности, анализ волокон и крахмала, осадок помещали в воду и / или глицерин и исследовали под световым и поляризационным микроскопами. Крахмальные зерна также наблюдались после окрашивания йодом / йодидом калия. Для анализа пыльцы остаток пропускали через водное сито (сито 0,5мм), подвергали ацетолизу и помещали в 50% водный раствор глицерина.

 

Литература

1. Ribechini E, Modugno F, Pérez-Arantegui J, Colombini MP (2011) Discovering the composition of ancient cosmetics and remedies: Analytical techniques and materials. Anal Bioanal Chem 401(6):1727–1738.

2. Perez-Arantegui J, Ribechini E, Colombini MP, Escudero F (2011) Characterisation of an ancient ‘chemical’ preparation: Pigments and drugs in the medieval Islamic Spain. J Archaeol Sci 38(12):3350–3357.

3. Stacey RJ (2011) The composition of some Roman medicines: Evidence for Pliny’s Punic wax? Anal Bioanal Chem 401(6):1749–1759.

4. Romualdi A (1990) I materiali. Relitto del Pozzino (B del Golfo di Baratti), Catalogo della mostra. Piombino 14-luglio-31 ottobre 1990, eds Nicosia F, Romualdi A (Edizioni Zeta, Florence, Italy), pp 31–34.

5. Romualdi A, FirmatiM (1998) Memorie sommerse. Archeologia subacquea in Toscana, Catalogo della Mostra, Fortezza spagnola di Porto S. Stefano, 31 maggio 1997, eds Poggesi G, Rendini P (Laurium Editrice, Pitigliano, Italy), pp 184–192. Italian.

6. Ciabatti E (1990) Relitto del Pozzino (B del Golfo di Baratti), Catalogo della Mostra. Piombino 14-Luglio-31 Ottobre 1990, eds Nicosia F, Romualdi A (Edizioni Zeta, Florence, Italy), pp 17–22. Italian.

7. Colombini MP, Modugno F (2009) Organic Mass Spectrometry in Art and Archaeology (Wiley, Chichester, UK).

8. Ribechini E, Orsini S, Silvano F, Colombini MP (2009 ) Py-GC/MS, GC/MS and FTIR investigations on Late Roman-Egyptian adhesives from opus sectile: New insights into ancient recipes and technologies. Anal Chim Acta 638(1):79–87.

9. Ribechini E, Modugno F, Colombini MP, Evershed RP (2008) Gas chromatographic and mass spectrometric investigations of organic residues from Roman glass unguentaria. J Chromatogr A 1183(1–2):158–169.

10. Henry AG, Hudson HF, Piperno DP (2009) Changes in starch grain morphologies from cooking. J Archaeol Sci 36(3):915–922.

11. Andersen ST (1979) Identification of Wild Grasses and Cereal Pollen (Danmarks Geologiske Undersøgelse Årbog, Copenhagen), pp 69–92.

12. Beug HJ (1961) Leitfaden der Pollenbestimmung für Mitteleuropa und angrenzende Gebiete [Pollen Guide for Central Europe and Adjacent Areas] (Gustav Fischer, Stuttgart). German.

13. Ciarallo A (2009) Plants as a major element in the cultural framework of Pompeii. Plants and Culture: Seeds of the Cultural Heritage of Europe, eds Morrel J-P, Mercuri AM (Centro Europeo per i Beni Culturali Ravello, Edipuglia, Bari, Italy), pp 63–67.

14. Boni M, Large D (2003) Nonsulfide zinc mineralization in Europe: An overview. Econ Geol 98:715–729.

15. Pliny the Elder, Storia Naturale, trans Barchiesi A (1988) (Giulio Einaudi, Torino, Italy). Book XXXIV, Chap 22, p 233. Italian.

16. Mattioli PA (1645) I discorsi di M Pietro Andrea Matthioli Sanese (Marco Ginammi, Venice, Italy). Book V, Chap 43, pp 732–733. Italian.

17. Gourevitch D (1998) Collyres romains inscrits. Hist Sci Med XXXII(4):365–372.

18. Evershed RP, et al. (2004) Archaeology: Formulation of a Roman cosmetic. Nature 432 (7013):35–36.

19. Pliny the Elder, Storia Naturale, trans Barchiesi A (1988) (Giulio Einaudi, Torino, Italy). Book XII, Chap 60, p 81. Italian.

20. Mattioli PA (1645) I discorsi di M Pietro Andrea Matthioli Sanese (Marco Ginammi, Venice, Italy). Book I, Chap 117, p 145. Italian.

21. Giachi G, De Carolis E, Pallecchi P (2009) Raw materials in Pompeian paintings: Characterisation of some colours from the archaeological site. Mater Manuf Process 24:1015–1022.

22. Colombini MP, Giachi G, Iozzo M, Ribechini E (2009) An Etruscan ointment from Chiusi (Tuscany, Italy): Its chemical characterisation. J Archaeol Sci 36(7):1488–1492.

23. Ribechini E, Pérez-Arantegui J, Colombini MP (2011) Gas chromatography/mass spectrometry and pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry for the chemical characterisation of modern and archaeological figs (Ficus carica). J Chromatogr A 1218(25):3915–3922.

 

 

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1216776110

[1] Гидроцинкит — вторичный минерал из класса карбонатов, открыт в 1853 году Кеннготтом Густавом Адольфом в Блайберге. (Все сноски в тексте от переводчиков)

[2] Смитсонит, цинковый шпат – довольно распространённый минерал класса карбонатов. Был назван в честь Джеймса Смитсона (1754—1829), который указал отличия этого минерала от гемиморфита.

[3] Mortarium - один из класса древнеримских гончарных кухонных сосудов. Они представляют собой «полусферические или конические чаши»

[4] Energy-dispersive X-ray spectroscopy — аналитический метод элементарного анализа твёрдого вещества, базирующийся на анализе энергии эмиссии его рентгеновского спектра, вариант рентгеноспектрального анализа.

[5] Fourier-transform infrared spectroscopy – совокупность методов измерений спектров различной природы (оптических, ЯМР, ЭПР и др.), в которых спектр вычисляется не по интенсивности сигнала, как например, в призменных спектроскопах, а по отклику во временной (ЯМР, ЭПР, масс-спектроскопия) или пространственной области (для оптических спектроскопов). Термин Fourier-transform спектроскопия происходит от того, что преобразование Фурье (математический процесс) необходим для перевода сырых данных в спектр.

[6] X-ray powder diffraction - метод исследования структурных характеристик материала при помощи дифракции рентгеновских лучей (рентгеноструктурный анализ) на порошке или поликристаллическом образце исследуемого материала.

[7] В алхимии, cadmia (латинский Cadmium) представляет собой оксид из цинка, который собирают по бокам печей, где выплавляли медь или латунь

[8] Collyrium – от греческого слова, обозначающего вид хлеба, круглую булочку, это лекарственная форма в виде круглых или удлиненных маленьких лепешек, хранящихся в футляре Во французской медицинской терминологии данное слово используется для обозначения «жидкого препарата с водным или масляным наполнителем, предназначенным для местного лечения глазных заболеваний».