Перечислите реакции иммунитета

Практические занятия

                                     по темам «Реакции иммунитета»

                              «Учёт результатов серологических реакций»

1. Допишите определение:

 

Антиген – это полимер органической природы,

генетически чужеродный для макроорганизма, при попадании в последний вызывающий иммунные реакции, направленные на его устранение.

Антитело – это особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности B-лимфоцитов в виде мембран связанных рецепторов и в сыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул, и обладающих способностью очень избирательно связываться с конкретными видами молекул, которые в связи с этим называют антигенами.

Перечислите свойства антигенов

1.  чужеродность,

2.  специфичностью

3.  иммуногенностью.

 

Практическое применение реакции антиген – антитела

К реакции антиген – антитело можно применить закон действующих масс и определить константу равновесия Кр, которая и представляет собой константу аффинности (сродства).

Аффинность относится к связыванию антитела с одной антигенной детерминантой (эпитопом) или моновалентным гаптеном.

 

Вместе с тем, количество антигенсвязывающих участков в молекуле антитела может быть два и более. Антигены, со своей стороны, могут быть как моновалентными (например, гаптены), так и поливалентными (например, микробная клетка). Сила взаимодействия поливалентных антител с поливалентными гаптенами получила название авидность.

 

Авидность – суммарная сила взаимодействия антитела с антигеном.

 

Поливалентность антигена и антител существенно усиливает прочность их соединения, так как для диссоциации комплексов антиген – антитело необходим разрыв сразу всех связей.

 

Авидность – степень прочности связывания молекулы антитела с молекулой антигена.

 

Чем выше аффинность (степень сродства), тем выраженнее и авидность (прочность связывания). Авидность тем сильнее, чем больше связывающих центров.

Перечислите реакции иммунитета

 

В Основе реакций иммунитета лежит специфическое взаимодействие между антигеном и антителами. Реакции происходят в том случае, если антиген и антитела соответствуют, специфичны друг для друга. Следовательно, реакции иммунитета можно использовать в двух направлениях: 1)с помощью известных антигенов определить наличие антител в сыворотке крови больного и 2)с помощью известных антител, которые содержатся в иммунной сыворотке, определить вид и тип микроорганизма.

 

Поскольку в реакциях иммунитета участвует сыворотка, их называют серологическими (лат. serum - сыворотка).

 

Процесс взаимодействия антигена и антитела происходит в две фазы. Первая фаза - это специфическое соединение антигена и антител, вторая - неспецифическая, видимая фаза, происходит обычно в присутствии электролитов. Видимое проявление зависит от антигена: если это корпускулярный антиген, например, микробы, то образуются хлопья (агглютинация), если антиген растворимый (молекулярно-дисперсный), например, белки или полисахариды, то образуется осадок (преципитация)
Реакция нейтрализации токсина антитоксином.

 

В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами - антитоксины. При их взаимодействии происходит нейтрализация токсина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитоксической сыворотки. Внешнее проявление реакции - флоккуляция (помутнение).

 

Для обнаружения токсина с диагностической целью при ботулизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксином в биологическом опыте на животных

 

Реакция агглютинации

 

Реакция агглютинации - склеивание бактерий под влиянием

 

специфических антител. Реакция протекает в две фазы. В первой

 

фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй - образование хлопьев в присутствии электролита (хлорида натрия). Видимая реакция происходит в том

 

случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому их них присоединяется антиген, и в результате образуется "решетка".

 

Методы постановки реакции агглютинации:

 

1)развернутая реакция агглютинации ставится в пробирках с последовательными разведениями сыворотки;

 

2)реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:5 - 1:10; наступает в течение нескольких минут.

 

Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют а г г л ю т и н и р у ю щ у ю с ы в о р о т к у, полученную из крови животного (кролика, барана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыворотки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию.

 

Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, образуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, наступающая быстро - в течение двух часов.

 

Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает тонкозернистую агглютинацию в течение 18-24 часов.

 

Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации животных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специфичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом адсорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Полученные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела только к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С такими сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае не является ориентировочной.

 

Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в качестве известного антигена используют убитые культуры микробов, так называемые д и а г н о с т и к у м ы. При постановке серологического диагноза учитывают диагностический титр сыворотки

 

- для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.

 

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации

 

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях:

 

1)Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

 

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых пластин и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кружевного зонтика", при отрицательной реакции - плотный осадок эритроцитов в виде "пуговки".

 

2)Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

 

Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест)

 

Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh+ эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антитела не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антителами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов.

 

Реакция преципитации

 

Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.

 

Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осторожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципитата.

 

Реакцию применяют в судебной медицине для определения видовой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических исследованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кролика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наибольшее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.

 

Реакция преципитации в геле агара проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.

 

Р е а к ц и я д в о й н о й и м м у н о д и ф ф у з и и (п о О у х т е р л о н и). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердения в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммунные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.

 

Р е а к ц и я р а д и а л ь н о й и м м у н о д и ф -

 

ф у з и и (п о М а н ч и н и). В растопленный агаровый

 

гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических монорецепторных сыворотках.

 

Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направлению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образу-

 

ются линии преципитации.

 

Реакции иммунного лизиса

 

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфическими антителами, образует иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эритроциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.

 

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритроцитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - "лаковую кровь". Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.

 

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

 

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, образуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

 

Реакция связывания комплемента

 

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител, и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут или 18-20 часов в холодильнике.

 

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

 

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрица-

 

тельная (антител в исследуемой сыворотке нет), комплемент останется свободным, и произойдет гемолиз.

 

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонореи, сыпного тифа и других заболеваний.

 

РСК можно применять для определения антигена, например, вируса. В этом случае в качестве антител применяется диагностическая иммунная сыворотка.

 

В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана.

 

Реакции с участием меченых антигенов или антител

 

Реакции основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сыворотка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).

 

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изотиоцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.