Методы исследования биопсийного и секционного материала

В лаборатории патологоанатомического отделения должны быть отработаны и в любой момент применены сле­дующие методики: окраска гематоксилином и эозином, ре­зорцин - фуксином, по Ван Гизон, методы окраски, предна­значенные для выявления амилоида, фибрина, кератина и слизи по Крейбергу, извести по Коссу, железа по Перлсу, липидов Суданом III и Суданом черным (таблица 4).

Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например, анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кар мин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричне­вый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, ниль­ский голубой), тианин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и другие.

Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результа­те связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновыс и сульфоновые кислоты, нитро-, азокрасители и другие. В гистологической практике постоянно применяют эозин, пик­риновую кислоту, кислый фуксин, конго красный (конго-рот), азокармин, эритрозин. На практике чаще использую! 1 % водные растворы этих красителей, но можно применять и 1% спиртовой раствор.

Продолжительность окрашивания колеблется от 5 с до 3-5 мин в зависимости от сорта и серии красителя. Если препа­рат перекрашивается, то излишек краски легко удаляется при ополаскивании в дистиллированной воде и последующем обезвоживании препарата или среза в спиртах.

Гистохимические исследования позволяют выявить лока­лизацию химических соединений в клетке и тканях при со­хранении их структуры, а также изучение механизмов и спе­цифичности реакций, используемых с этой целью. Результат гистохимического анализа в равной мере зависит от качества проведения гистохимической реакции и подготовки материа­ла. Процесс подготовки включает взятие образца ткани, фик­сацию, промывание, обезвоживание, заливку в парафин или синтетические смолы и приготовление срезов, мазков или отпечатков. На каждом из этих этапов важно правильно вы­брать методику, обеспечивающую наилучшую сохранность исследуемых веществ при одновременной сохранности, на­сколько это возможно, прижизненной структуры клеток и тканей.

Гистохимические методы позволяют выявить белки, угле­ воды, жиры, ферменты. Информация, получаемая с помощью гистохимических методов, гораздо более ценных, чем это может показаться на первый взгляд. С помощью гистохими­ческих подходов удается обнаруживать нарушения обмена веществ не только на тканевом, но также часто на клеточном и субклеточном уровне.

При некоторых патологических состояниях, особенно опухолях, бывает трудно и даже невозможно с помощью гисто- или цитологических окрасок определить тип ткани или ее происхождение (гистогенез). Между тем верификация здесь имеет важное значение для диагностики и прогнозирования. Поэтому используют различные дополнительные методиче­ские подходы. Одним из них является иммуноморфологический метод.     

Современные иммуноморфологические методы исследо­вания основаны на высокоспецифическом взаимодействии антигена с антителом, что при наличии соответствующих ме­ченых антител позволяет выявить практически любой ткане­вой или клеточный антиген.

В первые годы развития иммуноморфологии гистологи были вынуждены либо сами, либо совместно с иммунологами и биохимиками получать антитела к интересующему их анти­гену. В настоящее время производят коммерческие поли- и моноклональные антитела к широкому спектру антигенов. Тем не менее проблема выработки антител к некоторым, в основном нестандартным антигенам в лабораторных услови­ях до сих пор достаточна актуальна.   

Поликлональные антисыворотки, получаемые при имму­низации животных, обычно кроликов, коз или овец, содержат антитела к различным эпитопам иммуногена. Наиболее важным преимуществом поликлональной антисыворотки являет­ся то, что она образует крупные нерастворимые интенсивно окрашиваемые при иммуногистохимическом исследовании комплексы с антигеном благодаря одновременному связыва­нию антител с многими эпитопами антигена. Высокая гетеро­генность поликлональной антисыворотки, обусловленная од­новременной выработкой антител к различным эпитопам им-муногена, обусловливает и ее недостатки.

Недостатки поликлональных антисывороток удалось уст­ранить G. Коblеr и С. Milstein [1975], которые предложили метод с использованием моноклональных антител. В основе метода лежит создание гибридомы путем слияния В-лимфоцитов селезенки иммунизированного животного и культуры клеток миеломы, полученных из плазматических клеток опухоли того же животного.

Важным преимуществом моноклональных антител, проду­цирующихся в большом количестве одиночными клонами клеток гибридомы, является то, что они идентичны по моле­кулярной организации, специфичности и сродству к антиге­ну. Однако специфичность к определенному эпитопу антиге­на не исключает перекрестной реакции, т. к. структура эпитопа иммуногена может быть характерна также для других известных и неизвестных соединений.

Недостатками моноклональных антител по сравнению с поликлональными антисыворотками является то, что: а) они связываются только с одним участком молекулы антигена, и это обуславливает низкую чувствительность метода, прояв­ляющуюся в слабом иммуноокрашивании на срезах; при единственном эпитопе высока вероятность того, что фикса­тор его недоступным для антител, в результате чего не про­изойдет иммуноокрашивание. Указанные трудности можно отчасти преодолеть, если для выявления антигена использо­вать смесь моноклональных антител, выработанных к раз­личным эпитопам того же иммуногена, а для иммунизации -«фиксированный» антиген.

С помощью электронной микроскопии изучают в основном те же объекты, что и в световом микроскопе. В ходе ди­агностических исследований на материала, взятом при жизни [больного, нередко используется электронная микроскопии [трансмиссионная (в проходящем пучке, подобно светооптической микроскопии) и сканирующая (снимающая рельеф поверхности). Первую применяют чаще, особенно для изуче­ния в ультратонких срезах ткани деталей строения клеток, выявления микробов, вирусов, отложений иммунных и других комплексов. Основные этапы обработки материала сле­дующие: иссеченный маленький кусочек ткани диаметром 1 -1,5 мм немедленно фиксируют в глутаральдегиде или в дру­гом фиксаторе, затем в четырехокиси осмия. После проводки материал заливают в специальные эпоксидные смолы или другую плотную среду. Ультратонкие срезы, нарезанные в ультрамикротомах, контрастируют (окрашивают), помещают на специальные сетки и исследуют в трансмиссионном элек-1ронном микроскопе. Ультраструктурные исследования стоят очень дорого, однако нередко применяются в онкоморфологии с диагностической и научной целями