Обоснование нашего исследования

На протяжении многих лет мы успешно тестировали определенные питательные микроэлементы как естественные ингибиторы вирусных инфекций и определили общие биологические цели для этих природных соединений - независимо от конкретных типов вирусов. Наши результаты показали, что витамин С, особенно в сочетании с другими природными соединениями, такими как лизин, экстракт зеленого чая, кверцетин и другие питательные микроэлементы, может влиять на ключевые механизмы, связанные с инфицированием вирусом гриппа человека H1N1 (Jariwalla 2007), птичьим гриппом H5N1 (Deryabin 2008), птичий грипп H9N2 in vitro и in vivo (Barbour 2009), а также ВИЧ (Jariwalla 2010). Эти питательные микроэлементы были эффективны в подавлении вирусной инфекционности, размножения, распространения и могли защитить инфицированные ткани от повреждений, связанных с инфекцией. Более того, эти природные компоненты обладают большей эффективностью в защите, например, клеток, инфицированных вирусом птичьего гриппа, чем противовирусные препараты, такие как Тамифлю и Амантадин (Дерябин, 2008).

Мы применили эти знания к текущей пандемии и исследовали эффективность питательных микроэлементов в подавлении клеточной экспрессии рецепторов ACE2, используемых коронавирусом для проникновения в клетки, в эпителиальных клетках легких и эндотелиальных клетках сосудов.

Реактивы

Все реагенты были предоставлены Sigma / Millipore, если не указано иное.

Клеточные культуры

Эпителиальные клетки малых дыхательных путей человека (SAEC, закупленные у АТСС) культивировали в среде для роста эпителиальных клеток дыхательных путей (АТСС) в пластиковых колбах при 37 ^o C и 5% CO ₂. Для эксперимента SAEC, пассажи 5-7, помещали на покрытые коллагеном 96-луночные пластиковые планшеты (Corning) в 100 мкл ростовой среды и выращивали до конфлюэнтного слоя в течение 4-7 дней.

Эндотелиальные клетки аорты человека (HAEC, приобретенные у Lonza) культивировали в среде для выращивания EGM-2 (Lonza) в пластиковых колбах при 37 ^o C и 5% CO ₂. Для эксперимента клетки через 5-7 пассажей высевали на покрытые коллагеном 96-луночные пластиковые планшеты (Corning) в 100 мкл среды EGM-2 и выращивали до конфлюэнтного слоя в течение 3-5 дней.

Клеточные добавки

Используемая комбинация питательных микроэлементов была разработана в Исследовательском институте доктора Рата (Сан-Хосе, Калифорния). Смесь, растворенная в 0,1 н. HCl согласно протоколу Фармакопеи США (USP 2040), была обозначена как исходный раствор. Для экспериментов в клетки добавляли указанные дозы добавок в 100 мкл / лунку среды для роста клеток в течение 3-7 дней. Рабочие концентрации добавок были выражены в миллионных долях исходной концентрации на мл (mpsc / мл). Питательный состав и дозировки, использованные в экспериментах, представлены в таблице 1. Воспалительный процесс в клетках SAEC был вызван совместной инкубацией с 10 нг / мл человеческого TNF-альфа или 100 нг / мл человеческого интерлейкина 6 (Sigma).

Анализ ACE-2 ELISA

Лунки культурального планшета дважды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и фиксировали раствором 3% формальдегид / 0,5% Triton X100 / PBS в течение 1 часа при 4 ° C, затем промывали четыре раза PBS. Добавляли 200 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина БСА (Sigma) в PBS и инкубировали планшет при 4 ° C в течение ночи. Кроличьи поликлональные антитела против ACE-2 (Sigma) добавляли к 100 мкл 1% BSA / PBS в течение 1,5 ч инкубации при комнатной температуре (RT). После трех циклов промывки 0,1% BSA / PBS в лунки добавляли 100 мкл антител против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP, Sigma), в течение 1 часа при комнатной температуре. После трех циклов отмывки 0,1% BSA / PBS сохраняющуюся активность HRP определяли путем инкубации со 100 мкл раствора субстрата TMB (Sigma) в течение 20 мин при комнатной температуре с последующим добавлением 50 мкл 1 н. H ₂ SO _4. и измерение оптической плотности при 450 нм с помощью микропланшетного ридера (Molecular Devices). Результаты выражены в процентах от экспериментального контроля без добавления добавки (среднее +/- SD, n = 6). Среднее значение неспецифического контроля (лунки, инкубированные без антител против ACE2) (n = 6) вычитали из значений всех образцов.