Применение эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации) в биотехнологии

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) - особый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы с размерами, превышающими максимальный диаметр пор, вообще не удерживаются и элюируются первыми, перемещаясь одновременно с подвижной фазой. Молекулы с размерами, меньшими чем минимальный диаметр пор сорбента, свободно проникают в поры и элюируются из колонки последними. Остальные молекулы, имеющие промежуточные размеры, удерживаются в порах частично и в ходе элюирования разделяются на фракции в соответствии со своими размерами и, частично, формой проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. В результате вещества элюируются с различными временами удерживания.

 

 

Если говорить о белках, то большинство из них имеют компактную форму молекул, но некоторые из них имеют цилиндрическую форму и вследствие этого больший гидродинамический радиус в растворе и поэтому элюируются раньше, чем ожидается. Более того, различные подвижные фазы могут способствовать изменению формы молекул в растворе (гидродинамического радиуса или радиуса инерции), что приводит к изменению порядка элюирования.

Для наиболее успешного разделения, поддержания растворимости веществ и исключения нежелательных вторичных взаимодействий подбираются определенные условия хроматографии: размер пор, выбор колонки, скорости потока, температура, а также параметры подвижной фазы: ионная сила, рН, добавление органических модификаторов. 

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярных масс веществ по графику зависимости объема удерживания веществ от логарифма их молекулярных масс, определения молекулярно-массового разделения полимеров методом сравнения со стандартными образцами и определения относительного компонентного состава смесей по отношению площади пика к сумме площадей пиков.

Эксклюзионная хроматография широко используется для характеризации биотерапевтических молекул в процессе их разработки и производства.

С помощью данного метода обеспечивается качественное разделение и исследование белков, которые содержат агрегаты, вспомогательные вещества, клеточный детрит (мертвое органическое вещество) и другие загрязнения, образующиеся при деградации белков.

Гель-фильтрация также нашла применение как мягкий способ обессоливания растворов ферментов, белков, олигосахаридов.  

Поскольку эксклюзионная хроматография подходит для разделения и количественного определения белковых смесей, она является ценной методикой контроля качества при производстве рекомбинантных белков. Контроль качества включает измерение агрегатов (димеров, тримеров, тетрамеров и т. д.) или отделение эксципиентов (вспомогательных веществ) и загрязнений с низкой молекулярной массой от более крупных белков.

Хроматограмма разделения агрегатов и вспомогательных веществ поликлональных IgG

Также эксклюзионная хроматография является оптимальным способом контроля процесса осахаривания и изучения состава сусла в спиртовой промышленности. Гель-фильтрацией проводят разделение углеводных компонентов зернового осахаренного сусла в виде ди-, олиго-, полисахаридов с целью их качественного и количественного определения. Обычно строится график зависимости объема удерживания веществ от логарифма их молекулярных масс.

Примером использования эксклюзионной хроматографии являются клинические испытания биоаналога инсулина. Гель-фильтрация позволяет обнаружить примеси и агрегаты, наличие которых в лекарственных препаратах недопустимо [5].

 

Также эксклюзионная хроматография может использоваться в комбинации с ионообменной хроматографией в качестве одного из этапов очистки, например, препарата фактора свертывания крови VIII, который используют при лечении гемофилии А, препарата, получаемого из плазмы крови.

Эксклюзионная хроматография может использоваться для фракционирования водорастворимых производных полимеров природного происхождения. К ним относятся эфиры целлюлозы и хитозан, они играют важную роль в нефтяной, текстильной, пищевой, фармацевтической, косметической отраслях промышленности.

Недавно было показано, что методом эксклюзионной хроматографии можно разделять на индивидуальные компоненты даже смеси простейших минеральных электролитов, таких как две кислоты, кислота и ее соль или соль и основание.

 

Таким образом, гель фильтрация представляет собой метод разделения молекул в соответствии с их размером. В отличие от ионообменной и аффинной хроматографии молекулы образца не связываются с сорбентом, таким образом, состав буфера не влияет на разрешающую способность метода (расстояние между пиками). Следовательно, важным преимуществом ГФ является то, что условия среды могут быть изменены в соответствии с типом образца или требованиями для дальнейших этапов очистки или хранения. ГФ подходит для биомолекул, которые чувствительны к изменениям рН, концентрации ионов металлов и другим условиям среды. Разделение может быть выполнено в присутствии необходимых ионов, детергентов, при высокой или низкой ионной силе, при 37 градусах цельсия или на холоду в соответствии с требованиями эксперимента.

Ограничения же гель-фильтрации связаны по большей части с частым несовпадением величины молекулярной массы и пространственных размеров молекулы, что может усложнять подбор неподвижной фазы, необходимой для нормального фракционирования. Также иногда могут проявляться вторичные взаимодействия в лице адсорбционных взаимодействий из-за повышенного сродства к матрице геля. Примером может служить адсорбция ароматических соединений на стиролдивинилбензольных гелях. Также одним из мешающих факторов является гидродинамический режим хроматографирования, в котором роль неподвижной фазы играют стенки колонки и разделение смеси макромолекул или частиц происходит вследствие различия скоростей протекания подвижной фазы вдоль оси канала и у его стенок, а также за счет распределения разделяемых частиц по сечению канала в соответствии с их размером.

 

Метод эксклюзионной хроматографии возможно использовать для определения средней молекулярной массы полимерных аналитов, включая природные вещества (полисахариды, крахмалы и др.) и синтетические полимеры (полиэтиленгликоль или оксид полиэтилена).

Хроматограмма олигомеров полиэтиленгликоля

 

Список используемой литературы

1. https://www.gluvexlab.com/uploads/storage/katalogy/5991_3651RU-Eksklyuzionnaya-khromatografiya-dlya-analiza-biomolekul.pdf Дата обращения 21.09.2020

2. http://www.eurasiancommission.org/ru/act/texnreg/deptexreg/LS1/Documents/2.2.30%20Эксклюзионная%20хроматография.pdf Дата обращения 21.09.2020

3. Preparative frontal size-exclusion chromatography of mineral ions on neutral hypercrosslinked polystyrene Vadim Davankov ∗, Maria Tsyurupa Nesmeyanov-Institute of Organoelement Compounds, Vavilov Str. 28, Moscow 119991, Russia Available online 7 March 2005

4. Высокоэффективная жидкостная хроматография ОФС.1.2.1.2.0005.15

5. https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-6872RU.pdf Дата обращения 21.09.2020

6. Сравнение двух альтернативных методов хроматографической очистки при получении препарата фактора свертывания плазмы крови человека в дозировке 500 единиц/флакон А.В. Ямкин, О.В. Стронин, Л.Н. Никитина Филиал ФГУП «НПО Микроген» Минздравсоцразвития России в г. Томск, 2011.

7. Эксклюзионная хроматография осветленного сусла для производства этанола С.В, Востриков, С.Ю. Болдырев, М.И. Соколов Воронежская государственная технологическая академия Известия ВУЗов, пищевая технология, 1998.

8. Стерическая эксклюзионная хроматография водорастворимых полисахаридов А.С. Боймирзаев Ташкентский государственный технический университет, Ташкент, 2009.