Выделение, очистка БАВ и получение готовой продукции

Ция).

Биосинтез БАВ (вторая стадия, главная фермента-

Стадия биосинтеза, главная ферментация – основная биологическая стадия процесса получения БАВ из культуры тканей. Задача этой стадии – обеспечение для продуцента БАВ таких условий развития, которые бы способствовали максимальному уровню биосинтеза БАВ. Эффективность стадии биосинтеза зависит от уровня образования БАВ из культуры ткани и определяется генетическими особенностями организма, составом питательной среды, режимом развития продуцента. Она также зависит от вреени максимального образования БАВ, стоимости компонентов среды, пеногасителей и энергетических затрат, связанных с процессом развития организма – продуцента БАВ.

4.2.1 Суспензионное культивирование для биосинтеза БАВ.

Для крупномасштабного культивирования растительных клеток для препаративного получения вещества вторичного синтеза используют специальные металлические и стеклянные ферментаторы (биореакторы) различной конструкции (с мешалкой или барботажного типа). Режим ферментации периодический (накопительный) или непрерывный, главным образом хемостатный. Биосинтез продуктов вторичного синтеза проводят в ферментерах объемом от 0,1 до 63 м3 и более. Аэрацию культуральной биомассы осуществляют стерильным воздухом через барботер. Воздух стерилизуют, как правило, путем фильтрации на двух-трех последовательно установленных фильтратах. В ходе культивирования клеток растений регулируют температуру (25-37°С), рН и окислительно-восстановительные потенциал. Процесс культивирования ведут до тех пор, пока идет интенсивный синтез целевого продукта и в среде не будут исчерпаны

питательные вещества. При определении конца культивирования необходимо учитывать данные микроскопического контроля состояния культуры, отсутствие постоянной микрофлоры, концентрацию основных питательных веществ, биомассы, целевого продукта, рН.

Процесс развития – продуцента БАВ в ферментаторах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении разработанного регламента условий накопления БАВ. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотной среды рН, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учитывая потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источников углевода, азота, калия, магния, фосфора, аминокислот, витаминов), контролируется образование БАВ.

Особое внимание при развитии продуцента в ферментаторах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через организм –продуцент БАВ часто происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития штамма-продуцента БАВ в ферментаторе. Основная причина появления большого количества пены – высокая вязкость питательной среды, обусловленная обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментаторах при получении биомасссы используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специальные синтезированные

вещества (силиконы, диазобуталкарбомил и другие соединения).

Выращивание проводят в течение около 70 сут. в период ростового цикла осуществляют микробиологический, биохимический и визуальный контроль. Визуальный контроль проводят не реже одного раза в 10 дней – отбраковывают инфицированные ткани.

Полученные с помощью биосинтеза продукты оказываются в сложной смеси с другими продуктами жизнедеятельности, а также с веществами среды культивирования. Важнейшей задачей биотехнологии является очистка целевого продукта из этой сложной смеси. Решение этой задачи осуществляется обычно в две стадии: предварительная обработка биомассы и выделение, очистка БАВ.

Известно, что к БАВ, используемым в медицинской практике, предъявляются очень высокие требования:

- высокая степень очистки;

- фармакологическая активность;

- стерильность

Поэтому необходимо соблюдать высокую степень чистоты на всех стадиях и операциях – поддерживать в исключительной чистоте не только используемое оборудование, но и помещение, где осуществляется как биосинтез БАВ и так получение препарата из

него с соблюдением правил международной системы ЩМР.

4.3.1 Предварительная обработка биомассы.

Культура представляет собой суспензию клеток продуцента в культуральной среде. При этом целевой продукт может оказаться либо в составе клеточной биомассы, либо в культуральной среде (нативный раствор). Ясно, что в любом из этих случаев необходимо разделить клеточную массу и культуральную среду, что по сути является первым этапом очистки целевого продукта или на практике называется этапом предварительной обработки биомассы.

В зависимости от того, где БАВ сосредоточено (в культуральной среде или в клетке) применяют соответствующие методы его извлечения. Отделение нативного раствора от биомассы взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования.

Выделение БАВ из клеток организма – продуцента осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями.

Есть БАВ содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Для этого БАВ, содержащиеся в культуральной жидкости и в клетках

продуцента, переводят в осадок, а затем его экстрагируют. При суспензионном культивировании, если БАВ находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, которые не смешиваются с жидкой фазой, или осаждают в виде нерастворимого соединений, или сорбируют ионообменными силами.

Остаточная влажность биомассы после сушки не более 12%. Затем сухую биомассу подают на стадию выделения и очистки БАВ с аналитическим паспортом на содержание БАВ.__

4.3.2 Выделение и очистка БАВ.

Одной из особенностей стадии выделения и очистки является то, что при выделении БАВ приходится работать с весьма невысокими концентрациями выделяемого вещества (не превышающих 2%). В конце стадии очистки уже имеют дело с более высоким

концентрациями, достигающими 20-30%.

Цель очистки – извлечение БАВ из нативной жидкости или из клеток продуцента, концентрация его и освобождение (собственно очистка) от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высоко очищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.

БАВ растительного происхождения под влиянием жестких внешних факторов (повышенная температура, высокая кислотность и щелочность и др.) в ряде случаев теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходим

максимум осторожности.

Стадия выделения и химической очистки включает ряд процессов, начиная от обработки нативного раствора до сушки готового очищенного препарата. На этой стадии, в зависимости от свойств БАВ, его химического строения и места основного накопления применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используют экстракцию с системах жидкость – жидкость, экстракцию осадка, сорбцию на различных сорбционных материалах, мембранные методы очистки, кристаллизацию, упаривание, сушку.

При разработке процессов получения высокоочищенных биопрепаратов используются процедуры тонкой очистки. К ним относятся хроматографическое разделение, препаративный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, фракционное осаждение

(органическими растворителями, солями и т.п.) и ряд других.

4.3.3 Получение готовой продукции.

После выделения и химической очистки БАВ его необходимо высушить – удалить из препарата свободную и связанную воду.

Фасовку порошков производят в емкость из оранжевого стекла. Готовый порошок подвергается тщательному аналитическому, биологическому и фармакологическому контролю.