Снижение способности митохондрий накапливать кальций

Параллельно разобщению окислительного фосфорилирования наблюдается потеря способности митохондрий к накоплению ионов кальция. В присутствии избытка субстратов дыхания и при наличии кислорода и ортофосфата митохондрий печени способны накопить в матриксе количество фосфорнокислого кальция, по массе превышающее массу митохондрий в сотни и даже в тысячу раз! Повреждение митохондрий приводит к падению разности потенциалов на митохондриальной мембране. Положительно заряженные ионы кальция, удерживаемые в матриксе электрическим полем, начинают выходить наружу из поврежденных митохондрий. Способность митохондрий накапливать ионы кальция в присутствии субстратов и кислорода хорошо видна в опытах по измерению флуоресценции суспензии этих органелл, к которой добавлен флуорофор – антибиотик тетрациклин (еще лучше – хлортетрациклин, ХТ). Дело в том, что хлортетрациклин связывает ионы Ca2+, образуя флуоресцирующий комплекс. Но в водной среде квантовый выход этой флуоресценции довольно низкий, и комплекс флуоресцирует слабо. При переносе кальция в матрикс (в отсутствие фосфата!) его концентрация во внутренней митохондриальной мембране повышается (см. объяснение на рис. 3). На рис. 4 приведены результаты опыта, в котором к митохондриям в среде инкубации, содержащей субстраты, но не содержащей фосфата и АДФ, добавляли небольшие порции CaCl2. На введение первой порции митохондрии ответили усилением дыхания и ростом флуоресценции тетрациклина. Вторая порция кальция оказала меньший эффект, последующие добавки эффекта не вызывали, но вместо этого из митохондрий начал выходить кальций (падение флуоресценции), органеллы стали набухать (снижение светорассеяния) и дыхание стало расти, свидетельствуя об увеличении проницаемости мембран в состоянии 2 по Чансу. По-видимому, способность митохондрий аккумулировать кальций была ограничена, и в конце концов произошло повреждение митохондрий и выход кальция. Максимальная амплитуда, которая достигается суспензией, соответствует максимальному количеству кальция, которое могут поглотить митохондрии в отсутствие фосфата. Эта величина была названа "кальций- аккумулирующей способностью" митохондрий. Она, как и коэффициент дыхательного контроля, снижается при повреждении митохондрий и может служить показателем их интактности. На рис. 5 показано, что при небольшом повреждении митохондрий происходит частичное снижение этого показателя. При полном повреждении митохондрий возрастания флуоресценции при добавлении кальция к митохондриям вообще не происходит (на рисунке не показано). При тканевой гипоксии происходит параллельное снижение дыхательного контроля и кальций-аккумулирующей способности митохондрий, как это видно на рис. 2. Разобщение окислительного фосфорилирования и выход кальция из митохондрий имеют самые драматические последствия для клетки. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к выключению ионных насосов, выходу калия и вхождению ионов натрия и кальция в клетку из окружающей среды. Одновременная потеря митохондриями способности аккумулировать кальций приводит к тому, что попавший в клетку кальций ими также не удаляется. Это в свою очередь приводят к активации целого комплекса ферментных систем, активируемых ионами кальция, включая фосфолипазы, многие системы биосинтезов и протеинкиназы; метаболизм клетки вначале активируется, а затем дезорганизуется. Именно повреждение митохондрий является, согласно современным представлениям, тем переломным моментом, после которого изменения в клетке, вызванные повреждающим агентом, становятся необратимыми и клетка погибает.

Рис.3. Схема, поясняющая причину роста флуоресценции хлортетрациклина при накоплении ионов кальция в матриксе митохондрий

В отсутствие кальция хлортетрациклин (ХТ) равномерно распределяется между водной и мембранной фазами, но не флуоресцирует. При добавлении к среде кальция комплекс Са-ХТ частично входит в мембрану в соответствие с коэффициентом распределения между липидной и водной фазами. Однако его концентрация в липидной фазе невысока из-за низкой концентрации в водной фазе (рисунок слева). При повышении концентрации кальция в матриксе пропорционально растет концентрация комплекса Са-ХТ во внутреннем липидном слое внутренней мембраны митохондрий, и флуоресценция. суспензии существенно усиливается.

Рис.4. Изменение флуоресценции митохондрий, окрашенных тетрациклином, в ответ на поглощение и выход ионов кальция.

Ф-ХТ - флуоресценция хлортетрациклина;

СР - светорассеяние;

O2 - концентрация кислорода.

Стрелками показаны моменты введения митохондрий (мит), сукцината (Suc), хлорида кальция (Ca2+). Остальные объяснения даны в тексте.

Рис.5. Ответ флуоресценции хлортетрациклина (сплошные кривые) и восстановленных пиридиннуклеотидов (пунктир) при введении ионов кальция к интактным митохондриям (сверху) и митохондриям, выделенным из печени после 15 минут аноксии.