Отбор, консервирование, транспортировка и хранение материала для лабораторного исследования

Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А………… Г Т Т Т Ц А 4. Удаление всех негибридизированных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот. 5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации ДНК, то есть увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro с помощью фермента – термостабильной (выдерживающей многократный нагрев до 90оС) ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3/ - концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. ПЦР включает в себя три циклически повторяющихся процесса: 1. Плавление ДНК-матрицы – денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании реакционной смеси до 90-100оС. 2. Отжиг праймеров – гибридизация (комплементарное связывание) праймера с ДНК-матрицей (55-65оС). 3. Синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы – комплементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью ДНК-полимеразы из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (72оС). Стандартный цикл ПЦР – плавление, отжиг, синтез - воспроизводится многократно и в идеале количество амплификонов (амплифицируемый участок) растет в геометрической прогрессии. Весь цикл длится 3-5 минут и может повторяться до 20-40 раз. Теоретически за 30 циклов количество ДНК должно увеличиться в миллиард раз (20 циклов – в миллион раз). Индикацию амплифицированных ДНК производят известными методами: электрофорезом с окрашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно меченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуорометрическим, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот. Более подробно методы лабораторной диагностики описаны при лабораторных исследованиях инфекционных болезней животных в разделе «Специальная часть».

||

|| ||

Отбор материала для лабораторного исследования. Пра­вильный отбор материала и его транспортировка в значительной мере определяют успех исследований.

Материал берут с учетом клинических признаков болезни, ко­торые указывают на поражение той или иной системы, патологоанатомической картины при вскрытии (изменения в различных органах — печени, легких, кишечнике и т.д.), а также основыва­ясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфек­ции характерна определенная локализация возбудителя в орга­низме.

Материал для исследования берут прижизненно или посмерт­но (от павших или убитых с диагностической целью животных). Во всех случаях желательно материал брать от животных, не под­вергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2 - 3 ч после смерти нор­мальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культуры. Что­бы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследу­емый материал берут стерильно, с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортировки.

Трупы мелких животных направляют в лабораторию цели­ком.

Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каж­дый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспор­тируют в нативном виде или консервируют одним из способов.

Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, за­ворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пе­ресыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань.

Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца.

Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в количестве 15-20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы можно отбирать стерильной пастеров­ской пипеткой с последующим запаиванием ее кончика.

Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскива­ют стерильным физиологическим раствором, осушают стериль­ным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, пос­ледующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду.

Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного тампо­на на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении там­пона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным фи­зиологическим раствором. При взятии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.

Секрет молочной железы: сосок обмывают во­дой, обрабатывают этанолом, ополаскивают стерильным физио­логическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию секрета, для микробиологического исследования берут последу­ющие порции молока.

Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции.

Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрезки (сегменты) кишечника, перевя­занные на концах лигатурами. В остальных случаях интересую­щие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промыва­ют стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хло­рида натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с ре­гионарными лимфатическими узлами.

Фекалии берут стерильными ватными или ватномарлевыми ректальными тампонами, которые вводят на 8-10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирую­щие смеси. В противном случае нарушается исходное количе­ственное соотношение микробных видов и размножение некото­рых бактерий может привести к инактивации искомого возбуди­теля.

Консервирование, транспортировка и хранение материала. Ма­териал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т.д.), закупоривают.

При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с мате­риалом помещают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.

Транспортировку и хранение материала до исследования про­водят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопут­ствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганиз­ма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) поме­щают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиолоuического раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3: 1), температура смеси — 15 минус 20 °С; 2) равные части сухого льда и этанола, тем­пература смеси около —70 °С.

Для консервирования материала, содержащего энтеробактерии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема.

Глицериновая смесь: глицерин - 500мл, физиоло­гический раствор - 1000мл, рН смеси доводят до 7,8-8,0 добав­лением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Смесь стерилизуют дробно, текучим паром.

Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода - 1000мл, дигидрофосфат калия - 0,45г, гидрофосфат ка­лия - 5,34 г. Стерилизуют при 121 °С 20 мин.

Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны со­ставлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервиро­вания фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2-6°С.

В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого материал получен, харак­тер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме того, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико-эпизоотологических данных.

Поступивший в лабораторию неконсервированный материал можно хранить при 4 °С 1-2сут; консервированный в 50%-м ра­створе глицерина (кусочки органов) — несколько недель; для длительного хранения материал замораживают при —15-20 °С.

Кровь для серологических исследований у крупного рогатого скота, овец, лошадей берут из яремной вены в стерильные бак­териологические пробирки в количестве 10-15 мл, у свиней — из хвостовой, передней краниальной вен или глазного синуса, у птиц — из подкрыльцовой вен, у кроликов — из краевой уш­ной вены. Пробирки с кровью необходимо выдержать до фор­мирования сгустка в тепле (1,5-2 ч), затем для отделения от стенок пробирки обвести сгусток стеклянной чистой палочкой или спицей. Для отстаивания сыворотки пробирки с кровью по­мещают в холодильник при 4-6 °С на 18-20 ч. После ретракции сгустка сыворотку крови переливают в серологические пробир­ки с резиновыми пробками. При необходимости сыворотку крови консервируют, добавляя в пробирку несколько крупинок борной кислоты, тиомерсал (конечное разведение 1:10000), или замораживают.

Принципиальная схема лабораторного исследования

Диагностика инфекционных болезней включает в себя комплекс исследований: эпизоотологические, клинические, патологоанатомические, микробиологические. При важности каждого из них и ценности именно комплексного подхода микробиологическое исследование особенно важно, поскольку с его помощью либо непосредственно обнаруживают этиологический (причинный) агент болезни, либо косвенными специфическими иммунологи­ческими методами доказывают его присутствие.

Микробиологическое исследование состоит из следующих этапов.

1. Обнаружение возбудителя непосредственно в исследуемом материале без изоляции в виде чистой культуры на питательных средах. На этом этапе применяют разные методы.

Неиммунологические методы включают в себя: а) выявление возбудителя путем микроскопического исследования окрашен­ных (по Граму и т. д.) мазков-отпечатков из органов и тканей; б) обнаружение при помощи генетических методов (генные зон­ды, ПЦР) нуклеиновых кислот возбудителя.

Иммунологические методы заключаются в выявлении антиге­нов возбудителя с помощью различных серологических реакций (РП, РДП, МФА, ИФА, РНГА и т.д.).

2. Обнаружение возбудителя (его токсинов) в биопробе (зара­жают исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных).

3. Выделение культуры возбудителя из исследуемого материа­ла путем посева на питательные среды.

4. Идентификация выделенной культуры микроорганизмов по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и патогенных свойств. При этом широко используют серологические (РА, РП, РДП, ИФА и т.д.), а в слу­чае необходимости генетические методы идентификации изоли­рованных микроорганизмов.

5. Серологическая (ретроспективная) диагностика заключа­ется в том, что при помощи различных серологических реакций (РА, РСК, ИФА и т. д.) в сыворотке крови исследуемых живот­ных обнаруживают специфические следы пребывания возбуди­теля — антитела. Серологические реакции наиболее широкоприменяют при диагностике хронически протекающих бактери­озов.

6. Аллергическое исследование в отличие от перечисленныхвыше методов проводят непосредственно на животных в хозяй­стве. При помощи диагностических аллергенов у животных вы­являют состояние гиперчувствительности замедленного типа. Аллергическую пробу в основном применяют для иммунологи­ческой диагностики хронических бактериозов.

Изложенная схема отражает возможные, но не обязательные направления лабораторных исследований. При каждой конкретной инфекции схему исследования определяют особен­ности биологии возбудителя и инфекционного процесса.