Промышленное производство гентамицина сульфата

Гентамицина сульфат - антибиотик, относящийся к группе аминогликозидов; представляет собой смесь гентамицинов сульфатов, которые образуются культурой Micromonospora purpurea.

Гентамицин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе Proteus, Pseudomonas, не оказывает действия на грибы. Применяют гентамицин сульфат при различных инфекционных заболеваниях, вызванных чувствительными к нему микроорганизмами. Препарат особенно эффективен при инфекциях мочевыводящих путей, респираторных и желудочно-кишечных болезнях. В связи с широким спектром действия гентамицин назначают часто при смешанной инфекции, а так же когда возбудитель не установлен (в том числе, при общей экстренной профилактике).

Современное промышленное получение гентамицина сульфата - это сложная многоступенчатая система, состоящая из ряда последовательных технологических стадий (рис. 11):

	Приготовление посевного материала на агаризированной питательной среде

Рис.11. Схема получения гентамицина сульфата

Гентамицина сульфат представляет собой пористую массу или порошок белого цвета. Гигроскопичен, легко растворим в воде, практически не растворим в 95% спирте, хлороформе, эфире.

Приготовление посевного материала. Исходной в производстве гентаамицина является культура М.purpurea var. violacca штамм ВНИИ-7R, выращенная в пробирках на скошенной агаризированной среде Гаузе-1.

Подготовка посевного материала - одна из ответственных операций в цикле биотехнологических процессов получения гентамицина. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в биореакторе, так и биосинтез гентамицина в целом.

При получении вегетативного посевного материала второй генерации используют вегетативный посевной материал первой генерации, если он отвечает следующим требованиям:

-биомасса средней густоты от бежевого до розово-сиреневого цвета, при взбалтывании мицелий обволакивает стенки флакона, не оседает на дно и не расслаивается;

-при микроскопии окрашенного препарата наблюдаются микроколонии, гифы длинные или средней длины, волнистые, протоплазма базофильная, иногда в виде пунктира;

-посторонняя микрофлора отсутствует.

Выращивание вегетативного посевного материала второй генерации осуществляют в посевном биореакторе для глубинного культивирования, снабженного мешалкой, барбатером для подачи воздуха, рубашкой для нагрева и охлаждения среды. Приготовление посевной среды проводят в биореакторе БИОР-0,1.

Биосинтез гентамицина (культивирование). Процесс биосинтеза гентамицина в аппаратах БИОР 0,25 осуществляется методом периодического глубинного куль-тивирования.

Посевной материал вносят в ферментационную среду в количестве 5 - 10 % от ее объема. Культивирование длится 6-7сут. Режимы культивирования продуцента в биореакторе БИОР-0,25 меняют в процессе роста мицелия (табл. 18).

Таблица 18.

Режим культивирования продуцента гентамицина в биореакторе

БИОР-0,25

Регулируемые показатели	Продолжительность культивирования, ч
0-24 0-24	24-96	96 – до слива
Температура, С0 Расход воздуха на аэрацию, дм3 /мин Частота вращения мешалки, об/мин	37+1 3,5	33+1 4,16	33+1 3,5

Изменение режимов аэрации в биореакторе проводят с учетом массообменных характеристик аппаратов по сульфитному числу.

Давление в процессе биосинтеза поддерживается в пределе 0,05 -0,2 кгс/см².

При вспенивании культуральной жидкости вводят порционно 50см³ стерильного пеногасителя.

Предварительная обработка и ультрафилыирация культуральной жидкости. Культуральную жидкость из биореактора загружают в приемную емкость, включают насос на перемешивание и проводят предварительную обработку последовательным добавлением реагентов (растворы щавелевой кислоты, цетилперидиний бромида) для коагуляции белков и удаления поливалентных металлов.

Процесс ультрафильтрации осуществляют на установке типа УСФ-1. При ультрафильтрации культуральной жидкости происходит процесс концентрации растворов высокомолекулярных соединений (в том числе и антибиотиков) с одновременной очисткой их от низкомолекулярных примесей путем пропускания раствора через мембрану.

Сорбция гентамщина на катионите КБ-2 в аммонийной форме и десорбция.

Процесс выделения и химической очистки гентамицина на катионите КБ-2 включает следующие операции: сорбция гентамицина из нативного раствора, вымывание минорных компонентов, десорбция гентамицина.

Для сорбции гентамицина его нативный раствор из сборной емкости подают насосом снизу вверх на ионно-обменную колонку, заполненную катионитом КБ-2 в аммонийной форме.

В колонне десорбции проводят стадию химической очистки (удаление гентамициноподобных и окрашивающих примесей) и десорбцию гентамицина.

Вымывание минорных компонентов примесей проводят 0.043Н раствором аммиака, пропуская его через слой катионита в ионообменной колонне сверху вниз:

[R(СОО)₅ гентамицин-комплекс с минорными примесями] + 5NH4OH — [R(COO)₅ • гентамицин-комплекс без минорных примесей] + [ гентамицин подобные минорные примеси]⁺⁵.

Десорбцию гентамицина проводят 5%-ным раствором аммиака, пропуская его через колонну с катионитом сверху вниз.

Получение концентрата гентамицина. Полученный элюат гентамицина упаривают на роторном испарителе ИР-ЮМ при температуре 50 - 55°С и давлении 0,085 Мпа для удаления аммиака и концентрирования гентамицина до 60000-70000 мкг/см3.

Осветление концентрата гентамицина основания углем и перевод его в сульфат форму.

Очищенный и сконцентрированный гентамицин основания помещают в колбу и подкисляют раствор 20%-ной серной кислоты до рН 6-6,5, добавляют активированный уголь (7% от объема концентрата) и нагревают до 40-45° С при перемешивании 30 мин, затем уголь отфильтровывают.

Распылительная сушка водных растворов гентамицина сульфата. Распылительную сушку осветленного концентрата гентамицина сульфата производят на лабораторной сушилке типа УРС-0,5, предназначенной для распылительного обезвоживания растворов в асептических условиях. Осушителем является очищенный воздух.

Перед началом работы все детали сушильной камеры моют, протирают спиртом, собирают и высушивают горячим воздухом при 108 С⁰ .

Далее устанавливают значения температур воздуха-теплоносителя:

на входе в сушильную камеру -175-185° С;

на выходе из сушильной камеры - 103-105 °С.

Раствор антибиотика, подаваемый в сушильную камеру, распыляется в токе нагретого воздуха до мелких капель.

Фасовка, упаковка и маркировка препарата гентамицина сульфата. Загрузку и выгрузку препарата из сушилок, а также фасовку проводят в помещениях, где поддерживаются асептические условия.

Фасовка осуществляется в ламинарном боксе КОН-В. Порошок гентамицина сульфата переносят из приемной тары распылительной сушки в банки из оранжевого стекла с винтовой горловиной и навинчиваемой крышкой. На каждую банку наклеивают этикетку. На этикетке указывают министерство, предприятие-изготовитель, его товарный знак, название препарата, активность в 1 мг, содержание активного вещества в миллиардах ЕД, массу нетто, регистрационный номер, номер серии, срок годности, условия хранения (при комнатной температуре, в темном сухом месте).