Трансмиссионная (просвечивающая) и растровая (сканирующая) электронная микроскопия

Ход реакции

Приготовление реактивов

1. 3N раствор HCl: 266,4 мл концентрированной HCl, до 1 литра — дистиллированная вода. Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.

2. Реактив Шиффа.

3. Сернистая вода: 1,5 г —Na₂S₂O₅, 15 мл — 1N HCl, 300 мл — дистиллированной воды.

1. Препарат фиксируют в метаноле 15 мин.

2. Опускают в подогретый до 37 °С раствор 3N раствор соляной кислоты и помещают в термостат при 37 °С на 20 — 25 мин.

3. Промывают в отработанном реактиве Шиффа из холодильника.

4. Помещают в чистый реактив Шиффа при 37 °С на 45 — 60 мин.

5. Промывают в сернистой воде 3 раза по 3 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде.

7. Высушивают на воздухе и заключают под покровное стекло в заливочную среду.

Этот метод используют для окраски ядер клеток и метафазных хромосом.

Для каждой ткани существуют свои особенности фиксации, проводки, заливки и окраски. Очевидно, что изготовление срезов костной ткани и нервной различается. В качестве красителей используются самые разнообразные вещества, наиболее распространены анилиновые красители. Своеобразным вариантом красителя являются соли серебра, которые восстанавливаются в ходе окрашивания до металлического серебра, придающего окраску структурам.

Электронная микроскопия.

Электронный микроскоп был изобретен в 1933 году и является сложным прибором, в котором сочетаются достижения вакуумной техники и электроники. В электронном микроскопе вместо света используется поток электронов, а стеклянные линзы заменены электромагнитными полями. Источником электронов, т. е. катодом, служит вольфрамовая нить, испускающая электроны при нагревании. В центре анода имеется небольшое отверстие. Сквозь него проходят электроны, и пучок их фокусируется магнитной катушкой, играющей роль линзы, которая направляет его на объект. Когда пучок электронов уже прошел через объект, изображение его увеличивается с помощью второй магнитной катушки, которая действует как линза объектива; затем пучок электронов проходит через третью магнитную катушку, действующую в качестве окуляра или проекционной линзы и увеличивающую уже полученное изображение объекта.

Стабильность напряжения. Ускоряющее напряжение. Виброустойчивость электронного микроскопа. Тепловая стабильность. Система охлаждения. Вакуум в колонне микроскопа (около 10^-5 Па) обеспечивает прохождение электронного пучка и чистоту исследуемого образца. Гониометр.

Диапазон увеличений (от 800-1000 до 850 000 раз). Калибровка.

Формирование изображения на экране электронного микроскопа происходит за счет чередования активированных и неактивированных молекул флуорохрома, покрывающего экран, на который падает электронный пучок. На флуоресцирующем экране рассматривают изображение, проводят его фокусировку. Фотосъемка раньше проводилась на фотопленку или стеклянные фотопластинки, в современных микроскопах используют цифровые фотокамеры.

Требования к образцам для электронной микроскопии:

- оптимальная толщина

- неоднородность химического состава и присутствие атомов тяжелых элементов

- устойчивость к воздействию вакуума, температуры и электронного луча

Электронный микроскоп сразу нашел применение в физике, геологии, материаловедении, химии и других отраслях науки, изучающих неживые объекты.

Изучение кристаллов, пленок. Изучение полупроводников. Материаловедение. Изучение «старения» материалов, изменений структуры при различных воздействиях. Изучение магнитных лент (распределение ферромагнетиков на поверхности, их ориентация и т.п.).

Изучение роста кристаллов. Контроль процесса образования кристаллов. Применение микродифракции в электронном микроскопе для анализа нарушений кристаллической структуры различных соединений, для изучения структуры пленок, образующихся в разных условиях (вакуум, возгонка и пр.). Изучение сплавов. Изучение биметаллов (структура раздела).

Анализ химического состава материалов: (1) рентгеновская спектрометрия (дисперсионный спектрометр анализирует генерируемое электронами излучение и определяет элементный состав образца); (2) анализатор энергии (измеряет потерю энергии электронов, пролетающих через образец и т.о. определяет элементный состав. Очень малая площадь образца). Компьютерная обработка.

Четырёхмерная электронная микроскопия (4D electron microscopy) - новая разновидность электронного микроскопа способна генерировать видео на атомном уровне, показывающее тончайшие изменения, происходящие в материалах при внешнем воздействии или в ходе химических реакций. Новая установка способна раскладывать на множество кадров события, длящиеся триллионные доли секунды. Оригинальная техника съёмки, названная четырёхмерной электронной микроскопией (4D electron microscopy), разработана в физико-биологическом центре науки и технологии ультрабыстрых процессов (Physical Biology Center for Ultrafast Science and Technology — UST) Калифорнийского технологического института. В основе устройства — система, которая позволяет контролировать с высокой точностью траекторию каждого отдельного электрона, направляемого на образец. Причём изображение снимается (фиксируется отражённый сигнал) также по отдельности для каждого электрона (а они идут с точно отмерянными интервалами в фемтосекунду (10⁻¹⁵ с), а не для их "обобщённого" потока, как в установках прежних поколений. Миллионы таких кадров, проигрываемых с нужной скоростью, формируют фильм, демонстрирующий ранее неуловимые изменения в образцах. Главный автор этого проекта Ахмед Зивейл (Ahmed Zewail) в 1999-м получил Нобелевскую премию по химии за разработку метода ультрабыстрой съёмки молекул, освещаемых сверхкороткими лазерными импульсами. Этот способ придал съёмке атомарного масштаба новое измерение — время, но не давал того высокого пространственного разрешения, которое присуще электронным микроскопам. В новом устройстве учёные сумели "соединить" оба принципа, впервые получив подвижную картинку в малом масштабе как во времени, так и в пространстве.

Для проверки аппарата они пронаблюдали за тонкими (порядка нанометра) листами золота и графита. Удалось визуализировать небольшие и очень быстротечные (с частотой порядка мегагерца) механические колебания таких структур (в частности, возникающие при быстром нагреве образца), которые можно было зафиксировать во всех деталях, только преодолев по шкале времени пикосекундный масштаб и пойдя дальше, практически к фемтосекундам.

Удивительный аппарат Titan, созданный в рамках американско-европейского проекта TEAM, получил свои первые изображения с рекордным разрешением 0,05 нанометра. Это равно четверти поперечника атома углерода. Чтобы понять, какие новый инструмент открывает возможности по изучению материалов или биологических молекул, нужно добавить, что диаметр спирали ДНК составляет целых 2 нанометра.

TEAM означает Transmission Electron Aberration-corrected Microscope, то есть трансмиссионный электронный микроскоп с коррекцией аберрации. Он появился в результате смешения двух технологий: электронного микроскопа сканирующего и трансмиссионного типов (так называемая технология S/TEM). Для повышения разрешения здесь был применён ряд новаций, в частности, сразу две оригинальные системы коррекции сферической аберрации.

Titan разработан в американском национальном центре электронной микроскопии при лаборатории Беркли (National Center for Electron Microscopy — NCEM), с самым непосредственным участием специалистов из американской национальной лаборатории в Окридже (Oak Ridge National Laboratory), ряда других организаций, а также из компаний FEI и CEOS. Эти две фирмы, кстати, не только спроектировали часть важных систем уникального инструмента, но собственно и построили микроскоп. В 2008 году этот микроскоп перевезут на место его постоянной работы – в NCEM, а в 2009-м он должен быть полностью отлажен, испытан и приступить к работе.

Электронная микроскопия биологических объектов.

Попытки рассмотреть в электронном микроскопе биологические объекты натолкнулись на ряд трудностей, для преодоления которых пришлось разрабатывать новые методы обработки биологических образцов. Живые клетки с помощью электронного микроскопа не исследуются. Очевидная причина - достаточно высокий вакуум в колонне, живые клетки, содержащие значительное количество воды, мгновенно повреждаются и гибнут при помещении их в вакуум и при облучении интенсивным потоком электронов.

Требования к образцу для электронно-микроскопического исследования: оптимальная толщина, неоднородность химического состава и присутствие тяжелых элементов; устойчивость к воздействию вакуума, температуры и электронного луча.

Особенности биологических объектов, определяющие характер подготовки материала для электронно-микроскопического исследования.

Химический состав биологических объектов. Сохранение структуры с помощью стабилизации химических связей (фиксация).

Способы соблюдения требования оптимальной толщины. Опорные пленки. Ультратонкие срезы.

Способы повышения контраста изображения (контрастирование солями тяжелых металлов, напыление). Изучение макромолекул с использованием метода напыления (оттенения) металлами (платина, палладий, золото). Недостатки метода: дает информацию только о внешнем виде объекта, увеличивает размеры объекта на толщину напыленного слоя (1—15 А).

Изучение нуклеиновых кислот методом напыления. Гетеродуплексный анализ.

Метод негативного контрастирования. Уранилацетат, фосфорно-вольфрамовая кислота. Области применения (быстрая диагностика (идентификация) вирусов, изучение вирусных суспензий, определение концентрации вирионов в суспензии (физический титр). Индикация бактериальных клеток. Достоинства метода: позволяет изучить форму и размеры вирусных частиц; изучить строение поверхности вирусных и частиц и бактериальных клеток.

Требования к препаратам: концентрация не ниже 10 ⁶ - 10 ⁷ частиц в мл; чистота.

Основные этапы исследования методом негативного контрастирования:

подготовка сеточек с подложкой; нанесение суспензии вируса (бактерий) на сеточку, экспозиция; экспозиция сеточки с контрастирующим веществом (уранилацетат, фосфорно-вольфрамовая кислота и др.); просмотр сеточки в электронном микроскопе.

Формирование изображения при негативном и позитивном контрастировании.

Метод криофрактографии (криоскалывание). Особенность метода – приготовление препаратов без химической фиксации. Этапы приготовления образцов (реплик): замораживание жидким азотом, приготовление скола и возгонка воды в вакууме, напыление углеродом и металлом, обработка кислотой. Этот метод сыграл важную роль в электронно-микроскопическом изучении клетки и в понимании её строения. Именно с помощью криофрактографии было показано, что альдегидная фиксация обеспечивает адекватное, соответствующее нативной (замороженной) клетке, сохранение клеточных структур.