Подготовка материала для светооптического исследования

Фотографирование

Измерения с помощью микроскопа

Измерить линейные размеры препаратов можно с помощью окуляр-микрометра, который входит в комплект микроскопов. На линзу окуляр-микрометра нанесена линейка, с помощью которой определяют, сколько делений укладывается в измеряемую структуру. Измерение может проводиться при разных увеличениях объектива. Для определения цены деления окуляр-микрометра используют объект-микрометр, который представляет собой прозрачную линейку, смонтированную в металлической пластике в форме предметного стекла.

Для определения объема структур, площади поверхности мембран и других количественных характеристик клеток и тканей используют метод морфометрии. Этот метод основан на представлении, что достаточное количество срезов некой гетерогенной объемной фигуры дает адекватное представление об ее структуре. Так, по срезам помидора можно представить себе целый помидор. Для характеризации микроскопических объектов разработана система параметров, позволяющая оценить соотношение разных типов клеток или клеточных структур в объеме, определить процентное содержание тех или иных структур, вычислить площадь поверхности мембран и ряд других параметров. Метод морфометрии трудоемкий, и поэтому следует хорошо подумать, прежде чем его применять.

Для фотографирования объектов в микроскопах используют фотонасадки. Традиционная съемка – на фотопленку и фотопластинки. Цифровая съемка. Преимущества и недостатки.

В настоящее время существует множество вариантов микроскопического исследования, и очень важно выбрать метод, адекватный поставленной задаче.

В световом микроскопе можно исследовать самые разнообразные образцы. Очень важно выбрать метод исследования, адекватный поставленной задаче. Нужно различать задачи: «увидеть что-то» и «изучить строение чего-то». В первом случае стоит использовать наиболее простые и доступные методы. Во втором – методы, обеспечивающие наиболее полную информацию об объекте.

Использование фиксированных объектов дает широкие возможности для разработки огромного числа методов окрашивания клеток и тканей, выявляющих различные компоненты клеток. Следует внимательно подходить к выбору фиксатора, и делать этот выбор с учетом последующих исследований материала, поскольку некоторые методы окраски разработаны для определенного вида фиксации. Фиксатор должен быстро проникать в ткани, опережая процесс аутолиза. Скорость проникновения (фиксации) зависит от многих параметров, для формалина она составляет около 1 см в сутки. Более плотные ткани фиксируются дольше. Очевидно, что чем меньше кусочек, тем лучше сохранность структур.

Процедура фиксации направлена на предотвращение распада тканей и клеток, на сохранение их прижизненной структуры. В процессе фиксации происходит инактивация клеточных ферментов, предупреждается диффузия растворимых белков, сохраняется структура ткани. Фиксация предотвращает рост бактерий и грибов в ткани. Существует множество разных фиксаторов, многие из которых направлены на фиксацию отдельных компонентов клеток и тканей, иногда – в ущерб остальным структурам.

Фиксаторы-смеси на основе уксусной кислоты. Существует много вариантов фиксаторов, включающих уксусную кислоту. Наиболее простые –

5% р-р уксусной к-ты в абсолютном спирте (фиксация по Уолмену и Бехару).

Фиксатор Карнуа – 10 мл абс.спирта + 3 мл хлороформа + 1 мл уксусной к-ты.

Более сложные фиксаторы могут включать в себя сулему, бихромат калия, метиловый спирт, пикриновую кислоту и ряд других добавок.

Сложный состав фиксирующих растворов отражает историю поиска оптимального фиксатора. Существует большое количество фиксирующих растворов, но общим для всех является механизм сшивки молекул образца непредельными связями молекул фиксатора. Практика показала, что наиболее адекватной, т.е. сохраняющей структуру, является фиксация альдегидными фиксаторами. В ее основе лежит сшивка биологических молекул альдегидными группами фиксатора, когда двойные связи стабилизируют химическую структуру клеток, соединяясь с их компонентами.

Наибольшее распространение получили альдегидные фиксаторы на основе формальдегида (формалина) и глутарового альдегида, причем первый используется несравнимо шире, поскольку его растворы более стабильны, а сам он существенно дешевле и доступнее.