Спиртовое брожение

Спиртовое брожение вызывают различные микроорганизмы. Чаще всего это дрожжи родов Saccharomyces, грибы родов Oidium, Mucor, Monilia. Могут вызывать брожение некоторые бактерии рода Clostridium, а также представители семейства Enterobacteriaceae. Для большинства микроорганизмов спирт является побочным продуктом и только для дрожжей рода Saccharo-myces – это главный конечный продукт брожения.

Дрожжи широко распространены в природе. Они встречаются на поверхности растений, в нектаре цветов, в водоемах, пищеварительном тракте человека и животных, в почве. В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах, содержащих углеводы. Это все, так называемые, "дикие дрожжи". Культуры дрожжей, применяемых в пищевой промышленности, выделены путем длительной селекции из диких дрожжей.

Основные возбудители спиртового брожения дрожжи-сахаромицеты являются факультативными анаэробами. В анаэробных условиях необходимую для жизнедеятельности энергию они получают путем сбраживания моно- и дисахаридов, а в присутствии кислорода воздуха – за счет аэробного дыхания. Из соединений углерода дрожжи лучше всего используют гексозы. Некоторые виды хорошо растут на средах с пентозами. Полисахариды используются дрожжами только после предварительного гидролиза. В качестве источника азота дрожжи используют обычно соли аммония, аминокислоты, пептоны, реже нитраты и нитриты. Аминокислоты дрожжи синтезируют самостоятельно, поэтому аммонийные соли могут быть единственными источниками азота. Для нормальной жизнедеятельности дрожжи нуждаются в соединениях фосфора (для синтеза протеинов и коферментов), в солях калия и натрия. При недостатке солей натрия задерживается почкование дрожжей, а в отсутствии этих солей дрожжи не растут. Некоторые дрожжи нуждаются в витаминах, другие – способны все необходимые для роста витамины синтезировать сами. Микроэлементы (железо, медь, кобальт) повышают активность ферментов дрожжей.

Оптимальная температура развития большинства видов дрожжей около 28-30⁰С, но температурный диапазон роста довольно широк – от 0⁰С (даже -7⁰С) до 48-50⁰С. Большинство дрожжей растет в границах рН от 3,0 до 8,0, оптимальное значение рН 3,5-6,5.

Первая форма брожения по Нейбергу. Перед началом спиртового брожения олигосахара вначале гидролизуются соответствующими ферментами дрожжей до гексоз. Затем гликолитическим путем осуществляется расщепление гексоз и образование ПВК. Под действием пируватдекарбоксилазы микроорганизмов от ПВК отщепляется СО₂ и образуется ацетальдегид:

ЭМП-путь ПДК

С₆Н₁₂О₆ → 2 СН₃СОСООН → 2 СН₃СНО + 2 СО₂

Ацетальдегид служит конечным акцептором водорода. Он восстанавливается в этанол при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Брожение предполагает строгое равновесие процессов окисления и восстановления. Поэтому НАД, восстановленный на одном из этапов брожения, должен окисляться на другом этапе. Окисление НАДН₂ происходит одновременно с восстановлением ацетальдегида в этанол:

АДГ

2 СН₃СНО + 2 НАДН₂ → 2 СН₃СН₂ОН + 2НАД⁺

Таким образом, при спиртовом брожении основным продуктом превращения сахаров является этанол и СО₂. Такой процесс Нейберг назвал первой формой брожения (рисунок Г.1). Суммарная реакция первой формы брожения: С₆Н₁₂О₆ → 2 СН₃СН₂ОН + 2 СО₂

Спиртовое брожение протекает наиболее интенсивно в кислой среде (рН 4,0-4,5), при температуре 30⁰С и концентрации сахара 10-15%. Повышенная концентрация сахара приводит к замедлению, а затем прекращению процесса. Спиртовое брожение является эндогенным процессом. Сахар адсорбируется на поверхности дрожжевой клетки, проникает внутрь и метаболизируется ферментами. Образующиеся при этом спирт и СО₂ диффундируют из клетки в окружающую среду. При увеличении концентрации сахара увеличивается осмотическое давление в дрожжевых клетках, происходит плазмолиз, в результате чего в клетках накапливается спирт и процессы метаболизма нарушаются.

Вторая форма брожения по Нейбергу. Ход брожения может заметно меняться в зависимости от конкретных условий. Если в культуру бродящих дрожжей добавить бисульфит натрия, то он связывает уксусный альдегид. Значит, ацетальдегид блокируется и исключается из последующего процесса:

СН₃СНО + NaHSO₃ → СН₃СНОНSO₃Na

В таких условиях акцептором водорода, оторванного от НАДН₂, является фосфоглицериновый альдегид, который превращается в глицерин-3-фосфат, а затем дефосфорилируется с образованием глицерина. Суммарная реакция второй формы брожения:

С₆Н₁₂О₆ → С₃Н₅(ОН)₃ + СН₃СНОНSO₃Na + СО₂

Суммарное количество синтезированной АТФ при такой форме брожения равно нулю и, следовательно, процесс не может обеспечить рост клеток, но его используют в промышленности для получения глицерина. Глицерин используется в кондитерской, парфюмерной и других отраслях промышленности.

Третья форма брожения по Нейбергу. Сходный вариант спиртового брожения происходит при подщелачивании среды (добавлении NaHСO₃ или Na₂HРO₄). В этих условиях ацетальдегид окисляется НАД-зависимой дегидрогеназой в уксусную кислоту. Образовавшийся на этой стадии НАДН₂ используется для восстановления эквивалентного количества ацетальдегида в этанол. Одновременно НАДН₂, получившийся при окислении 3-фосфорноглицеринового альдегида, используется для восстановления фосфоглицеринового альдегида в глицерин-3-фосфат, который затем превращается в глицерин. Суммарная реакция третьей формы брожения:

2 С₆Н₁₂О₆ + Н₂О → 2 С₃Н₅(ОН)₃ + СН₃СН₂ОН + СН₃СООН + 2СО₂

Такой химизм процесса благоприятен для клеток, поскольку образующаяся уксусная кислота снижает рН среды, после чего вновь возобновляется нормальное спиртовое брожение.

Спиртовое и глицериновое, или глицеринпировиноградное (ГПВК), брожения тесно связаны. В начальной стадии спиртового брожения появляется глицерин. Это объясняется наличием в начале брожения своеобразного периода индукции, т.е. времени, необходимого для накопления ацетальдегида. Таким образом, в начале преобладает ГПВК брожение. Но даже в период бурного спиртового брожения, наряду со спиртом, образуются другие продукты.

Эффект Пастера. В присутствии молекулярного кислорода (в аэробных условиях) дрожжи быстро переключаются с брожения на аэробное дыхание. При этом ПВК, образующаяся из глюкозы и других субстратов, окисляется через цикл Кребса до СО₂ и Н₂О. Кроме того, цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) обеспечивает клетки рядом метаболитов, необходимых для дальнейших биосинтетических реакций. В энергетическом отношении дыхание более выгодно, чем брожение. Поэтому в аэробных условиях дрожжи растут лучше и образуют большую биомассу.

Подавление брожения в аэробных условиях носит название эффекта Пастера, так как Пастер первым установил, что молекулярный кислород уменьшает образование этилового спирта и СО₂, но способствует активному размножению дрожжевых клеток. Этот эффект используется в дрожжевом производстве, где необходимо, чтобы сахар потреблялся на размножение дрожжей, для накопления их биомассы.

Эффект Крэбтри. Спиртовое брожение может происходить в условиях значительной аэрации при высоком содержании глюкозы в среде. Подавление аэробного дыхания при высокой концентрации глюкозы (высокой скорости ее усвоения) называется эффектом Крэбтри, или катаболитной репрессией. Этот эффект не наблюдается при выращивании дрожжей на средах, содержащих менее усвояемые сахара. Катаболитная репрессия аэробного дыхания не только снижает получение дрожжами энергии, но подавляет биосинтез промежуточных продуктов ЦТК и глиоксилатного цикла. В таких условиях необходимые для биосинтеза кислоты ЦТК образуются путем карбоксилирования ПВК при участии фермента пируваткарбоксилазы:

СН₃СОСООН + АТФ + СО₂ + Н₂О → СОСООНСН₂СООН + АДФ + Ф_н