Работа № 5. Количественное определение активности пероксидазы крови по методу Н.И. Симаковой

Принцип метода. Метод основан на окислении индигокармина кислородом, выделяющемся при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы. Активность фермента измеряется временем, необходимым для окисления индигокармина, который меняет окраску от сине-зеленого в желто-розовый цвет. Чем меньше время окисления, тем выше активность фермента.

Ход работы. В пробирку налить 2 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 4,7, прибавить 3 мл разбавленной в 1000 раз крови (см. работу 2), 2 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,001% раствора индигокармина. Содержимое пробирки тщательно перемешать и быстро внести в нее 2 мл 0,2 % раствора Н₂О₂. В момент внесения Н₂О₂ засечь по секундомеру время и зафиксировать время перехода сине-зеленой окраски в желто-розовую.

Расчет. Пероксидазное действие крови связано с количеством гемоглобина, количество которого у разных людей отличается, поэтому определяется индекс пероксидазной реакции. Это отношение времени окисления индигокармина, к процентному содержанию гемоглобина в крови, умноженное на 100%.

Примерный расчет. Допустим, что переход окрашивания жидкости произошел за 8 секунд, а количество гемоглобина в исследуемой крови составляет 80% (160 г/л гемоглобина принято принимать за 100%); следовательно, индекс пероксидазной активности будет равен:

^{8 сек × 100%} = 10

^80%

В норме пероксидазная активность крови колеблется от 30 до 50 секунд.

Работа № 6. Обнаружение перекисей в растительном масле

При длительном хранении происходит перекисное окисление непредельных жирных кислот в растительном масле. Органические перекиси и гидроперекиси являются сильными окислителями и окисляют соли железа (II0 в соли железа (III). Последние образуют с роданистыми солями хорошо растворимое в воде ярко окрашенное родановое железо.

Ход работы. В пробирку прилить 1 мл свежеприготовленного 2% раствора соли Мора (FeSO₄●(NH₄)SO₄●6H₂O, или двойной железисто-аммонийной сернокислой соли), добавить несколько капель 15 раствора роданистой соли – NH₄CNS или KCNS. Добавить 1 мл исследуемого растительного масла и сильно встряхнуть. Через несколько минут отметить появление окраски в нижнем – водном – слое.

Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний

Вид 1. А) А, В, Г, Д; Б) 1, 2, 3.

Вид 2. А) 1Б, И, К; 2А, В, Г, Д, Е; 3Ж; З; 4Ж,З,Л. Б) 1Б, 2А, 3А, 4Б, 5В, 6А, 7Б.

Вид 3. А) 4; Б) 1, 2, 3, 4, 5.

Вид 4. А) Е (-, -, -); Б) Е (-, -, -).