Информация к занятию. Жгутики являются органами движения у многих бактерий, представляя собой очень тонкие (0,02—0,05 мкм) невидимые в обычный световой микроскоп нити

Жгутики являются органами движения у многих бактерий, представляя собой очень тонкие (0,02—0,05 мкм) невидимые в обычный световой микроскоп нити, состоящие из сократительного белка флагеллина. По количеству и расположению жгутиков все подвижные бактерии подразделяются на следующие типы:

а) монотрихи — имеют один жгутик на одном из концов клетки;

б) амфитрихи - по одному жгутику на концах палочки;

в) лофотрихи - пучок жгутиков на одном конце;

г) перитрихи - большое количество жгутиков по периметру клетки.

Диаметр жгутиков намного меньше разрешающей способности светового микроскопа, поэтому для их обнаружения пользуются или специальными методами окраски (предварительное протравливание мазка танином для того, чтобы вызвать набухание жгутиков, с последующей импрегнацией препарата серебром), или изучают их при помощи электронного микроскопа жгутиков.

Наличие или отсутствие жгутиков у ряда бактерий является дифференциально-диагностическим признаком. Однако в связи со значительными трудностями обнаружения жгутиков и низкой воспроизводимостью метода их окраски, в практической работе наличие жгутиков оценивают путем изучения активной подвижности бактерий в живых неокрашенных препаратах и применения специальных методов микроскопии.

Техника приготовления препаратов «раздавленная» и «висячая» капли для изучения подвижности микроорганизмов. Для изготовления препарата «висячей» капли взятую петлей или пастеровской пипеткой каплю суточной бульонной культуры наносят в центр покровного стекла, после чего накладывают его каплей вниз на стекло с лункой, края которой предварительно слегка смазывают вазелином. Капля не должна касаться краев лунки. При приготовлении «раздавленной» капли на предметное стекло наносят небольшую каплю культуры, которую покрывают покровным стеклом.

Микроскопию живых препаратов («висячая» или «раздавленная» капли) производят с сильной сухой (х40) или иммерсионной системой при несколько затемненном поле зрения (немного прикрыть диафрагму и опустить конденсор). Для изучения подвижности микробов можно пользоваться фазово-контрастной или темнопольной микроскопией.

У некоторых бактерий поверхность покрыта нежными ворсинками – пилями или фимбриями, которые могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии. Пили общего типа обеспечивают прилипание бактерий к питательным веществам или клеткам хозяина, а половые пили принимают участие в половом процессе у бактерий – конъюгации.

Капсула состоит из полисахаридов, реже – из полипептидов, обладает малым сродством к красителям, поэтому для ее выявления применяют негативные методы окраски, например, метод Гинса-Бурри. У некоторых патогенных бактерий (пневмококк, сибиреязвенная палочка) капсула образуется исключительно в организме животного или человека, тогда как у других видов бактерий (например, клебсиеллы) капсулообразование наблюдается при культивировании на питательных средах. Капсула защищает бактерию от действия неблагоприятных воздействий внешней среды и факторов иммунитета. Имеются непатогенные виды бактерий, которые при размножении в растворе сахара образуют капсулы, при этом растворы приобретают слизистую консистенцию.

Споры. Некоторые виды палочковидных бактерий в неблагоприятных условиях существова­ния образуют споры. Спорообразующие палочковидные бактерии называют бациллами или клостридиями, а неспорообразующие - бактериями. Из патогенных бактерий спорообразующими являются сибиреязвен­ная палочка, возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма.

Спорообразование обеспечивает сохранение вида в неблагоприятных условиях. Спора по своей устойчивости к различным факторам внешней среды значительно превосходит вегетативную форму, из которой она образовалась. От вегетативной формы спора отличается меньшим содержанием воды и плотной, многослойной оболочкой, содержащей липиды, а также наличием особого вещества – дипиколината кальция, что обеспечивает высокую устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов, в том числе, высыханию, повышенной или пониженной температуре и проч. в течение длительного промежутка времени.

Процесс спорообразования заканчивается отмиранием и лизисом вегетативной формы. Попадая в благоприятные условия, спора быстро прорастает, вновь превращаясь в вегетативную форму. Спора, образующаяся внутри цитоплазмы бактериальной клетки, может иметь круглую или овальную форму, располагаясь в центре (центрально), на конце (терминально) или ближе к одному из концов (субтерминально) (рис. 2). Форма, величина и расположение споры являются характерной особенностью вида бактерий.

Рис.2. Центральное (а), субтерминальное (б) и терминальное расположение спор (в)

Сложные методы окраски

Применяются для выявления некоторых структурных элементов микробной клетки, для окраски бактерий, не поддающихся окраске простыми методами, для дифференциально-диагностических целей. Наиболее часто, помимо окраски по Граму, применяются методы Циля-Нильсена, Гинса-Бурри, Нейссера, Ауески, Романовского-Гимзы.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена. Бактерии, содержащие большое количество липидов, например, микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), не окрашиваются простыми методами. Для их окраски применяют концентрированные спиртовые растворы красителей, содержащие протравы (фенол), проводя окрашивание при подогревании.

Методика окраски:

· на фиксированный мазок накладывают соответствующего формата листок фильтровальной бумаги, на которую наносят несколько капель карболового фуксина Циля;

· препарат нагревают над пламенем спиртовки 2-3 раза до появления паров, наблюдая сбоку, на уровне предметного стекла;

· препарату дают остыть, удаляют бумажку с фуксином, промывают мазок водой;

· обесцвечивают препарат 3% соляно-кислым спиртом до прекращения отхождения красных струек, промывают водой;

· докрашивают в течение 3-5 мин. раствором метиленового синего. Препарат промывают, высушивают, микроскопируют. Кислотоустойчивые туберкулезные микобактерии при микроскопии рубиново-красные, тонкие, но могут быть изогнутыми, ветвящимися, зернистыми. Другие элементы мокроты окрашиваются в синий цвет.

Окраска спор по методу Ауески. В связи с многослойной структурой и особенностями химического состава споры они не окрашиваются обычными методами. Поэтому, как и при окраске по методу Циля-Нильсена, применяют концентрированный карболовый фуксин Циля. Окраска модифицированным методом Ауески выполняется по методу Циля-Нильсена, однако обесцвечивание проводится 0,5% HCl. Необходимо избегать грубой фиксации мазка над пламенем. Вегетативные клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, споры - в ярко-малиновый.

Негативный метод Бурри. Каплю культуры или другого материала (например, зубной налет для обнаружения спирохет) смешивают с каплей туши и из этой смеси делают препарат по типу мазка крови.

Выявление капсул по методу Гинса у Klebsiella pneumonae. Капсула не выявляется при окрашивании обычными методами, так как входящие в ее состав слизистые вещества полисахаридной природы, окрашиваются плохо или не окрашиваются совсем. Для выявления капсул (например, у пневмококка - Streptococcus pneumoniae) можно использовать простые или сложные (по Граму, Гинсу-Бурри) методы окраски, при этом в мазке, окрашенном простыми методами, на фоне окрашенной ткани органа видны мелкие неокрашенные капсулы, внутри которых попарно (диплококки) или одиночно располагаются грамположительные ланцетовидные пневмококки. Методика окраски капсул по методу Гинса-Бурри заключается в следующем:

· на предметное стекло наносят каплю жидкой натуральной туши и небольшую каплю воды, в которой эмульгируют исследуемую культуру;

· уголком шлифованного стекла обе капли перемешивают и по поверхности предметного стекла плоскостью шлифованного угла делают мазок. После подсушивания мазок осторожно фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают в течение 1-2 мин. разбавленным 1:3 фуксином Циля, высушивают и микроскопируют. При микроскопии фон препарата темно-бурый, клетки бактерий красные. Капсулы выглядят в виде бесцветных овалов вокруг красных клеток бактерий (рис. 7).

Окраска зерен волютина по методу Нейссера. Зерна волютина, являющиеся важным дифференциально-диагностическим признаком дифтерийной палочки (Corynebacterium diphtheriae) обладают метахромазией, т.е. окрашиваются некоторыми красителями иначе, чем цитоплазма клетки, и поэтому могут быть легко выявлены при применении специальных методов окраски.

Методика окраски:

· фиксированный мазок окрашивают в течение 2-3 мин раствором уксусно-кислого метиленового синего Нейссера, после чего промывают водой;

· обрабатывают раствором Люголя в течение 20-30 сек.;

· не промывая водой, препарат окрашивают раствором везувина в течение 10-15 сек.;

· мазок промывают, высушивают, микроскопируют. Клетки коринебактерий окрашены везувином в золотисто-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-коричневый, почти черный.

Окраска риккетсий по методу Здородовского представляет собой модифицированный метод Циля—Нильсена. Для этого 10-15 капель карболового фуксина Циля разводят в 10 мл дистиллированной воды, препарат окрашивают 5 мин, обесцвечивают его 0,01% раствором соляной кислоты в течение 1—3 сек., промывают водой и докрашивают 1% раствором метиленового синего. Риккетсии, содержащие высокое содержание липидов, сохраняют окраску фуксином, в то время как клетки, в которых паразитируют риккетсии, обесцвечиваются кислотой, окрашиваясь в синий цвет.

Окраска по методу Романовского-Гимзы. Краситель Романовского-Гимзы состоит из азура (продукта окисления метиленового синего) и эозина. Краситель перед употреблением разводят нейтральной дистиллированной водой из расчета одна капля красителя на 10 мл дистиллированной воды. Краситель наносят на препарат, предва­рительно фиксированный жидким фиксатором (обычно смесью Никифорова), на 1 ч, после чего препарат промывают водой и высушивают. При микроскопии ядра клеток красно-фиолетового цвета, цитоплазма – голубого. Метод Романовского-Гимзы используется для окраски спирохет, простейших, риккетсий. Спирохеты, в за­висимости от их химического состава (содержания нуклеопротеидов), окрашиваются в сине-фиолетовый (боррелии, лептоспиры) или розовый цвет (трепонемы).