Лекція 7

4. Если целевой продукт является эндометаболитом, т.е. находится внутри клетки, то для получения более плотной клеточной культуры проводят периодическое культивирование в режиме диализа. При этом питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану и через нее же отводится часть культуральной жидкости без клеток. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Этот метод не нужно путать с непрерывным проточным культивированием.

Метод проточного непрерывного культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей питательной средой.

В зависимости от того, на каком принципе основано поддержание постоянства концентрации клеток различают турбидостатический и хемостатический режимы непрерывного культивирования.

При турбидостатическом режиме культивирования постояннство концентрации клеток обеспечивается управляемым изменением скорости протока жидкости через аппарат за счет подачи больших или меньших объемов питательной среды. Наиболее распространенным методом определения концентрации клеток в культуральной жидкости является измерение светорассеивания (мутности) выходящего из ферментера потока с помощью прибора-нефелометра, измеряющего мутность жидкости по величине светорассеяния. Сам прибор посредством электрической схемы связан с насосом для подачи питательной среды или вентилем (краном), регулирующим эту подачу. Повышение концентрации клеток в культуральной жидкости, приводит к увеличению светорассеяния, что автоматически вызывает увеличение объема подаваемой в аппарат свежей питательной среды, и что, в свою очередь, приводит к вымыванию избыточных клеток. Наоборот, при уменьшении светорассеяния (снижении концентрации клеток) скорость протока жидкости через аппарат уменьшается и соответственно уменьшается процесс их вымывания из ферментера.

Недостатком турбидостатического режима является то, что в этом режиме невозможно достигнуть полного усвоения питательных веществ и при выделении целевого продукта они могут безвозвратно теряться или загрязнять его, усложняя процесс очистки. При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу и искажения его показаний. Однако имеются и определенные преимущества. Так, например, если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения его от заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм.

При хемостатическом режиме поддержание постоянства концентрации культуры продуцента осуществляется за счет регулирования не выходящего, а входящего потока. Сущность регулирования состоит в том, что концентрацию основного питательного вещества (или одного из основных), поступающего в реактор устанавливают на определенном уровне, который ограничивает (лимитирует) степень размножения микроорганизмов, поддерживая тем самым культуру микроорганизма в определенной нужной концентрации. Такой метод регулирования называется хемостатическим, а реактор - хемостатом.

Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малой скоростью протока жидкости и низкой концентрацией питательных веществ, что облегчает саморегулировку системы. Недостатком хемостатического метода регулирования является то, что в этом случае обычно не удается получить продукты в достаточно высокой концентрации и добиться полной утилизации питательных веществ.

Особенно неэффективными являются такие реакторы при получении различных вторичных метаболитов, таких как антибиотики. Это связано с тем, что процесс получения вторичных метаболитов состоит из двух стадий, и оптимальные условия для той или другой стадии могу существенно различаться между собой. Одноступенчатый хемостат в лучшем случае может обеспечить только компромис между разными условиями, оптимальными для этих двух условий. Условия, более благоприятные для каждой стадии жизненного цикла можно создать при использовании двух- или более ступенчатого хемостата. Однако такой установкой весьма сложно управлять и она требует больших капиталовложений. В настоящее время одноступенчатый и многоступенчатые хемостаты нашли применение в основном в различных процессах утилизации отходов и очистки сточных вод.

Еще одним недостатком непрерывного метода является то, что в таких аппаратах невозможно или очень трудно и неудобно использовать неразмножающиеся клетки, споры или чистые ферменты. Вымываемые из ферментера клетки или ферменты практически невозможно регенерировать (отделить, промыть, вернуть в аппарат) без потери активности и с сохранением асептики. Аналогичные проблемы имеют место и при периодическом культивировании. Это является весьма невыгодным с экономической точки зрения, учитывая высокую стоимость чистых ферментных препаратов и штаммов микроорганизмов, а так же сложность подготовки и запуска процесса.

Эффективным способом решения этой проблемы является использование так называемых иммобилизованных биокатализаторов (клеток или ферментов). Процесс иммобилизации заключается в (закреплении) молекул фермента или целых живых клеток на (или в) специальных носителях или насадках значительно большего (на много порядков) размера. При этом биокатализатор из фактически гомогенного становится гетерогенным. Существует целый ряд методов иммобилизации, основанных на механическом, физико-химическом и химическом закреплении ферментов и клеток на носителях природного или искусственного происхождения. После окончания процесса такой катализатор легко отделить фильтрованием от культуральной жидкости, очистить, а иногда даже регенерировать. Такие катализаторы обычно имеют большой срок действия, по сравнению с неиммобилизованными, удобны в обращении, но имеют гораздо более высокую стоимость и требуют использования специально сконструированных для их использования ферментеров, что препятствует их широкому использованию. (Более подробно об иммобилизованных биокатализаторах и специальных конструкциях ферментеров см. методичку “Инженерная энзимология”.

Лекція 7: