Методы, основанные на изучении поверхностных маркеров

В настоящее время для идентификации поверхностных структур лимфоцитов и ряда других клеток в основном используют 3 группы методов:

1) розеткообразование;

2) методы иммунофлуоресценции;

3) иммуноферментные методы.

Наиболее дешевым и в то же время достаточно точным методом определения численности популяции Т- лимфоцитов является метод розеткообразования. Метод основан на наличии сродства между рецептором СD₂ и гликопротеинами мембраны эритроцита барана. При смешивании лимфоцитов с эритроцитами барана образу­ются фигуры, получившие название розеток. Количество таких розеткообразующих клеток (Е-РОК) соответствуют количеству Т-лимфоцитов, для которых характерна экспрессия на поверхности СD₂ – антигена.

Другая модификация метода розеткообразования (ЕАС-розетки) используется для идентификации В-клеток. Известно, что на поверхности В-лимфоцитов имеется рецептор для С3-компонента комплемента. Для выявления этого рецептора лимфоциты смешивают с эритроцитами быка, последовательно обработанными ан­тиэритроцитарными антителами в субагглитинирующей концентрации и компле­ментом (свежезамороженной сывороткой крови мыши). Использование такого ис­точника комплемента гарантирует защиту эритроцитов от комплементзависимого лизиса. После совместной инкубации В-клетки образуют фигуры розеток.

Более прогрессивным является использование метода иммунофлуоресценции, который позволяет с помощью наборов моноклональных антител к различным СD-антигенам идентифицировать практически любые поверхностные структуры лимфоцитов.

Различают метод прямой и непрямой иммунофлуоресценции. Первый состоит в использовании анти-СD–моноклональных антител, к которым присоединена флуоресцентная метка. Чаще применяют флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ), дающий в ультрафиолетовых лучах зеленоватое свечение. При наблюдении в лю­минесцентном микроскопе клеток, обработанных мечеными антителами, можно ви­деть характерные светящиеся ободки, указывающие на то, что на поверхности дан­ной клетки экспрессированы соответствующие дифференцировочные антигены. Ме­тод непрямой иммунофлюросценции предполагает использование не­меченых моноклональных антител. Визуализация реакции осуществляется с помо­щью вторых антител (например, козьи антитела против иммуноглобулина мыши, если моноклональные антитела были получены на основе мышиной гибридомы), несущих флуоресцентную метку.

Применение иммуноферментного метода, когда ко вторым проявляющимся антителам вместо ФИТЦ присоединяется пероксидазная метка, особенно удобно для небольших иммунологических лабораторий, так как не требует дорогих люми­несцентных микроскопов. Цветную реакцию, возникающую при взаимодействии фермент-субстрат, можно наблюдать в обычный световой микроскоп.

Универсальным методом исследования лейкоцитов является метод лазерной проточной цитофлуориметрии, который позволяет не только получить детальные характеристики клеточных субпопуляций, но производить их препаративное разде­ление. Прежде всего, на основе анализа светорассеивания (без применения антител) в исследуемом образце можно определить содержание лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Используя метод иммунофлуоресценции (прямой или непрямой), можно опреде­лить численность различных субпопуляций лимфоцитов. Помимо регистрации све­чения, возможна оценка его интенсивности. Обработка полученных данных по спе­циальной программе позволяет вычислить плотность данного рецептора на клеточ­ной мембране. За ограниченный отрезок времени можно произвести больше число анализов.

Помимо определения численности популяций и субпопуляций, важное значе­ние придается вычислению показателя СД4/СД8-так называемого хелперно-супрес­сорного отношения.

Определение соотношения лимфоцитов с хелперной и супрессорной функ­циями допустимо производить в теофиллиновом тесте.

Принцип метода заключается в том, что в присутствии теофиллина Т-лимфо­циты с супрессорной функцией теряют способность к Е-розеткообразованию. Такие клетки получили название теофиллинчувствительных (ТЧ). Так называемые тео­филлинрезистентные (ТР) клетки в значительном проценте случаев содержали суб­популяцию Т-лимфоцитов с хелперной активностью. Показатель ТР/ТЧ в норме со­ставляет 2,5 – 3,5.