Введение. Методы иммуноанализа, основанные на применении меченых компоне

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ, ИММУНОЛОГИИ

Д.А. Черношей, Т.А. Канашкова

Методы иммуноанализа, основанные на применении меченых компонентов

Учебно-методическое пособие

Минск 2007

УДК

ББК

К14

Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве учебно-методического пособия 31.01.2007, протокол № 5.

Авторы: канд. мед. наук., доцент каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии Черношей Д.А., канд. мед. наук, доцент Канашкова Т.А.;

Рецензенты:

Директор ГУ РНПЦГТ, д-р мед. наук, профессор Потапнев М.П., зав. каф. общ. хим., д-р биол. наук, профессор Барковский Е.В.

Методы иммуноанализа, основанные на применении меченых компонентов: Учеб.-метод. пособие/ Д.А.Черношей, Т.А. Канашкова. -Мн.: БГМУ, 2007. - с.

ISBN

Отражены вопросы классификации, характеристики, схем постановки, применения существующих методов иммуноанализа. Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2 курса всех факультетов.

УДК

ББК

ISBN	©Белорусский государственный медицинский университет, 2007.

Список сокращений

ИА	-	Иммуноанализ
РИА	-	Радиоиммунный анализ
РАСТ	-	Радиоаллергосорбентный тест
ИФА	-	Иммуноферментный анализ
ТИФА	-	Твердофазный иммуноферментный анализ
ELISA	-	enzyme linked immunosorbent assay
ЭС, ELIspot	-	Элиспот, enzyme linked immunospot
ИБ	-	Иммуноблот (вестернблот)
SDS	-	Sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия
ИГХ	-	Иммуногистохимия
EMIT	-	Иммуноанализ с измерением активности фермента (enzyme monitored immunoassay technique)
ФИА	-	Флуоресцентный иммуноанализ
РИФ	-	Реакция иммунофлуоресценции
ФИТЦ	-	Флуоресцеина изотиоцианат
ФЭ	-	Фикоэритрин
ИКК	-	Иммунокомпетентные клетки
CD	-	Cluster of definition
Th1, 2, 3	-	Т-хелперы 1-го, 2-го и 3-его типов
ФИА ВР	-	Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением
ЛИА	-	Люминесцентный иммуноанализ
ЛИКА	-	Люминесцентный иммунокофакторный анализ
ЛИФА	-	Люминесцентный иммуноферментный анализ
ХИА	-	Хемолюминесцентный иммуноанализ
ХИФА	-	Хемолюминесцентный иммуноферментный анализ
ХИСА	-	Хемолюминесцентный иммуносубстратный анализ
АТФ	-	Аденозин-3-фосфат
NAD	-	Никотинамид-адениндинуклеотид
ЭХИА	-	Электрохемолюминесцентный анализ
ИС	-	Иммуносенсор
МЭ	-	Микроэррей
IgE	-	Иммуноглобулин класса Е
ИХА	-	Иммунохроматографический анализ

Введение

Настоящий материал посвящен современным методам иммуноанализа, основанным на применении высокоактивной и специфичной метки - маркера, позволяющего непосредственно обнаружить продукт иммунной реакции. Такие методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью, требуют минимального количества биоматериала, позволяют получить количественные, объективные результаты, позволяют осуществлять скрининг или диагностику на ранних стадиях заболевания при минимальных изменениях в организме или объекте исследования. Эти методы явились результатом эволюции ранних методов иммуноанализа, в которых иммунная реакция обнаруживалась по визуальному изменению состояния реагентов (агглютинация, преципитация, пассивная агглютинация), либо по характерному изменению биообъектов, добавляемых к реакционной смеси для выявления протекания реакции (РСК).

Ситуация изменилась в 50-ых годах прошлого столетия (рисунок 1) после разработки и публикации метода определения инсулина (Berson S.A. et Yalow R.S.), основанного на конкурентном радиоиммунном анализе (РИА).

Вскоре (В 60-ых годах) были разработаны принципы применения меченных изотопами антител для иммуноанализа, «сэндвич»- и твердофазный радиоиммуноанализ (радиоаллергосорбентный тест (РАСТ, Wide L.); иммунорадиометрический анализ (ИРМА, Mile L., Hales C.N.)). Немного позже был предложен иммуноферментный анализ (ИФА, Engvall E., Perlmann P., Rubinstein K и др.).

Рисунок 1. Развитие методов иммуноанализа

Мощный импульс развитию иммуноанализа дала разработка технологии получения моноклональных антител (Milstein С.), после чего стало возможным полномасштабное развитие методов с применением ферментных, флуоресцентных и других меток (флуоресцентный иммуноанализ (ФИА, Etkins К., Wallac О.), хемолюминисцентный иммуноанализ (ХИА), гибридизация, технологии иммуносенсоров (ИС) и микроэрея (МЭ)).

В целом, эволюция иммуноанализа последние 50 лет идет в следующих направлениях:

· повышение чувствительности и специфичности:

· применение моноклональных антител;

· применение рекомбинантных антител;

· применение рекомбинантных и синтетических антигенов;

· применение fusion-белков (рекомбинантные белки, продукты слияния различных генов для придания молекулам желаемых свойств: специфичности, структуры, биохимической или рецепторной активности);

· применение аптомеров (одноцепочечный олигонуклеотид, проектируемый для специфического связывания с белками или другими нуклеиновыми кислотами);

· разработка методов с повышенным сотношением сигнал/шум:

· твердофазный ИФА в «сэндвич»-модификации, ФИА с временным разрешением, электрохемолюминесцентный иммуноанализ (ЭХИА);

· упрощение и ускорение анализа:

· отказ от конкурентного анализа в пользу неконкурентного;

· отказ от радиоизотопных меток в пользу ферментных или флуоресцентных (хемолюминесцентных);

· создания ускоренных методов иммуноанализа, не требующих специального оборудования и навыков (иммунохроматография (ИХА), дот-ИФА, и др.);

· создания наборов для одновременного исследования нескольких параметров;

· миниатюризация анализа:

· уменьшение размеров устройств;

· сокращение количества образца, необходимого для анализа;

· сокращение количества реагентов, необходимых для анализа.
Таблица 1. Классификация современных методов иммуноанализа

Группа	Метод иммуноанализа (ИА)	Характеристика определяемого вещества
I. Конкурентные методы, основанные на применении меченого антигена	ХИА ИФА РИА ФИА	Любые антигены, антитела
II. Конкурентные методы, основанные на применении меченых антител	ХИА тИФА (ELISA) ФИА	Любые антигены, антитела
III. Методы, основанные на агрегации и осаждении, подсчете частиц	Нефелометрический ИА Турбидиметрический ИА Латекс-агглютинация	Поливалентные антигены и частицы значительных размеров, поливалентные антитела
IV. Методы, основанные на применении избытка антигена или антител	ИРМА тИФА (ELISA) ФИА ХИА	Поливалентные антигены достаточных размеров (не гаптены)
V. Методы для определения специфических антител (антиген в избытке, фиксированный на твердой фазе)	тИФА РАСТ	Специфические антитела, IgE
VI. Методы, основанные на модификации активности ферментной метки при связывании	ИА с измерением активности фермента (EMIT) Поляризационный ФИА ИА с гашением флуорес-ценции и др.	Гаптены, лекарственные препараты