Диагностика. При характерном течении болезни постановка диагноза не представляет сложности при вспышке болезни на фоне пассивного или поствакцинального иммунитета

При характерном течении болезни постановка диагноза не представляет сложности При вспышке болезни на фоне пассивного или поствакцинального иммунитета, а тем более в стационарно неблагополучном хозяйстве поставить диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают эпизоотическую ситуацию, клиническую и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования - выделение ви­руса на КЭ, его индикация и идентификация в РГА - РТГА, определение вирулентности ви­руса на КЭ и цыплятах, а также выявление AT в сыворотке переболевших или вакциниро­ванных птиц в РТГА.

Выделение вируса. Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голо­ву, легкие, трахею и селезенку от только что павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в период вспышки болезни. Через 15 дн выделить его обычными методами, как правило, не удается Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки (в первые 3-5 дн) и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внут­ренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина на дистиллирован­ной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре не выше 4°С. Мазки-отпечатки исследуют методом ФА, срезы - с помощью ЭМ или ИЭМ, а суспензию - в РГА. Это позволит выявить специфический АГ (вирус) и ГА-агент в течение 3-5 ч, определить направленность дальнейших исследований.

Заражение КЭ. Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2 мл, не менее 10 КЭ на ка­ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72 ч при 37,5°С (погибших в первые 24 ч эмбрионов не учитывают). Если через 72 ч нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ ин­кубируют до 120 ч и затем убивают Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на ГА в РГА с куриными эритроцитами (1-5%-ная взвесь) Обычно велогенные штаммы вируса вызывают гибель КЭ уже через 32-60 ч после заражения, мезогенные - че­рез 60-90, а лентогенные - через 100 ч и более. Иногда при первом пассаже не удается выде­лить вирус, поэтому необходимо провести не менее 3-х "слепых" пассажей Учитывая, что в вакцинируемых стадах можно выделить и вакцинный вирус (шт Н, La Sota, Бор 74/ВГНКИ и др), вторым этапом исследования должно быть определение патогенности выделенного изолята Первым ориентиром могут служить данные РГА Обычно полевые изоляты обла­дают низкой ГА-активностью, проявляя ее в разведениях 1 16 - 1.128, тогда как вакцинные штаммы, наоборот, проявляют высокий ГА-титр - 1-256 - 1-2048.

Ненадежным оказался метод выделения вируса от зараженных иммунных кур: чем вы­ше иммунитет у несушек, тем меньше вероятности выделения вируса из их эмбрионов. При исследовании большого количества полевых образцов на выделение вируса НБ можно ис­пользовать фрагменты ХАО, связанные с яичной скорлупой. Для этого фрагменты ХАО размером 0,6-1,0 см² культивируют в среде Игла. Эффективность выделения вируса 97% При внесении вируса в среду культивирования или непосредственно на ХАО КЭ получены совпадающие результаты.

Заражение культуры клеток. Выделение вируса в культуре клеток осуществляется редко, так как культуральный вирус по ГА-активности значительно уступает эмбрионально­му. Однако в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов КЭ и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и идентифика­ции вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом. Можно использовать переви­ваемые линии ВНК-21 и Нер-2.

В зараженной культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48-60 ч вызывает ЦПИ, спе­цифичность которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур С вирус-содержащей культуральной жидкостью может быть поставлена РГА в отношении эритроци­тов крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не пре­вышает 1:32- М28. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре ткани не дают основания исключить НБ.

Заражение птиц. Если КЭ под руками нет, вирус можно выделить на неиммунной к НБ птице. Для этого испытуемый материал Г10 (0,5 мл) внутримышечно инокулируют цыпля­там в возрасте 2-4 мес. За инфицированной птицей наблюдают 10-12 дн. При появлении ха­рактерных для болезни симптомов птиц в агональном состоянии убивают и берут пробы го­ловного мозга и селезенки, которые используют для заражения КЭ и иммунологической пробы (для одновременного заражения птиц иммунной и неиммунной групп).

Титрование вируса. Обычно проводят на КЭ, культурах клеток по общепринятой ме­тодике и на 6-10 нед цыплятах Доза инокуляции вируса для цыплят 0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дн.