Схема расположения сайтов рестрикции

В том случае, если один из этих генов (например, ген устойчивости к тетрациклину) разрезать определённой рестриктазой, то при встраивании в это место фрагмента чужеродной ДНК целостность гена нарушается и определяемый им признак исчезает. Это позволяет легко отбирать гибридные плазмиды, специальным образом введённые в бактериальные клетки кишечной палочки E. coli при помещении ихв твёрдую питательную среду с антибиотиками ампициллином и тетрациклином и на среду только с ампициллином.

Трансформированные бактерии E. coli, т. е. содержащие гибридные плазмиды, растут на среде с ампициллином, но не растут в среде с двумя антибиотиками. Селективный рост позволяет отбирать и выращивать только клетки, содержащие гибридные молекулы ДНК.

Кроме плазмид в качестве векторов также успешно используют фаги и вирусы. В последнее время появились космиды – особый тип векторов, сочетающих свойства плазмиды и фага.

Сегодня уже получают тысячи химерных плазмид, каждая из которых содержит специфический фрагмент, например ДНК человека, мыши или дрозофилы. Посредством скрининга большого числа таких плазмид возможно исследовать весь геном любого из этих организмов.

Большие фрагменты хромосомной ДНК имеют размер около 15 кб: т.е. «килобаз». Это единица, используемая для выражения размера нуклеиновых кислот (1 кб = 1000 нуклеотидов). ДНК нестабильная в составе плазмид, становится весьма стабильной при встраивании её в специально сконструированные штаммы фага λ. ДНК этого фага сравнительно невелика, гены его хорошо изучены и размножается он в бактериальных клетках очень интенсивно.

При получении λ-векторов используется то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага λ не нужна для репликации в E. coli, а функционирует только при интеграции фаговой ДНК в бактериальную хромосому. При этом были сконструированы специальные штаммы λ, в ДНК которых сайты для рестриктазы EcoRl расположены таким образом, что правый и левый концевые фрагменты фаговой ДНК, необходимые для репликации, остаются нетронутыми. После расщепления с помощью EcoRl эти концевые фрагменты благодаря их большим размерам легко отделить от всех остальных EcoRl – фрагментов. Затем использовать их для получения новых λ- подобных фагов, каждый из которых содержит левый и правый концевые фрагменты, а также вставку чужеродной ДНК размером около 15 кб. Удобным оказалось то обстаятельство, что для созревания фага λ его ДНК должно иметь длину около 45 кб, благодаря чему при конструировании химерных ДНК in vitro для последующего размножения отбираются только те из них, которые содержат оба конца фаговой ДНК и вставку чужеродной ДНК подходящего размера, т. е. около 15 кб.