Изопикническое центрифугирование

Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярная масса которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают.

Перед началом центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости; при скоростном центрифугировании частицы не достигают изопикнической точки, а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуемые частицы не достигнут зоны с соответствующей плотностью и образец суспензируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости

Изопикническое разделение без градиента плотности.

Изопикническое разделение без градиента плотности.

Перед центрифугированием частицы распределены по объему центрифужной пробирки равномерно; после центрифугирования более легкие частицы всплывают наверх, в то время как тяжелые оседают на дно пробирки.

Эта особенность используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности.

Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. Молекулы сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а, следовательно, и плотности CsCl, так как ионы цезия обладают большей массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеинов плазмы крови человека.