Фаговые векторы

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 тпн. Для работы с более крупными фрагментами ДНК (5-25 тпн) разработаны векторы на основе бактериофагов. Трансформирующая активность фагов в 1000 раз выше, чем у плазмид. Для клонирования в клетках E. сoli широко используются фаги λ и М13.

После проникновения фага в клетку бактерии развитие фага может идти по двум путям. Если реализируется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизируется) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. Это хорошо видно по осветлению культуральной суспензии. При другом пути ( лизогенном ) фаг включается в хромосому бактерии как профаг и реплицируется в клетке вместе с бактериальной хромосомой. При неблагоприятных условиях (недостаток питательных веществ и т.д.) интегрированная фаговая ДНК высвобождается и запускается литический цикл развития. В природе основной приток генов в бактерии за счет трансдукции обусловлен лизогенными умеренными фагами.

В середине молекулы ДНК фага λ (длиной около 50 тпн) расположен участок хромосомы (около 15 тпн), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагментов путем размножения рекомбинантного бактериофага.

Чтобы получить лизаты (т.е. суспензии с фагами) бактерии, несущие лизогенные фаги, обрабатывают ультрафиолетом, митомицином С или повышенной температурой. Хранят лизаты фагов над хлороформом, который убивает все неинфицированные и неиндуцируемые клетки донора.

Для упаковки молекул ДНК в фаговую частицу in vitro смешивают в пробирке бесклеточные экстракты двух штаммов E. coli. В одном штамме содержится мутация, приводящая к инактивации одного из белков фагового капсида, а в другом штамме – мутация, препятствующая включению фаговой ДНК в головку бактериофага. Таким образом, хотя экстракт каждого по отдельности штамма содержит пустые головки, фаговую ДНК и отростки, полноценный фаг в этих экстрактах не образуется. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов E. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций и сборке полноценных фаговых частиц. При этом образуется 10⁴ – 10⁵ фаговых частиц на 1 мг упаковываемой ДНК.

Космиды - это небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos -сайты ДНК фага λ. Поскольку размеры многих генов животных и растений велики (35-40 тпн), они не могут быть эффективно клонированы с помощью плазмид или фагов (вмещающих 15-25 тпн) при создании геномных библиотек. В этих случаях используются космиды, обладающие большой емкостью.

По существу от фага в космиду вставляется лишь небольшой участок ДНК фага (cos -сайты), а вместо остальной фаговой ДНК вставляется плазмида (например pBR322). Именно за счет этого размер вставляемой чужеродной ДНК увеличивается до 50 тпн. Используя космиду, в присутствии фага-помощника чужеродная ДНК может быть упакована в фаг и после лизиса клеток отобрана в виде фаговых частиц. Однако такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной и не может размножаться как обычный фаг, поскольку у нее нет ДНК, кодирующей белки, необходимые для сборки фага. После адсорбции такой фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 тпн. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селективные маркеры в виде устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания. Таким образом, стадия упаковки ДНК космид в фаг используется лишь для того, чтобы облегчить процесс введения рекомбинантной ДНК большого размера внутрь бактерий. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции.

Фазмиды.- векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, как у фага λ, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий. Эти векторы как и фаговые, используются для клонирования кДНК и геномной ДНК, с эффективностью инфицирования клеток E. coli в 100 раз выше, чем при трансформации плазмидами. Это существенно облегчает конструирование банков генов, содержащих до миллиона независимых клонов.