Обратная транскриптаза

РНК-зависимая ДНК-полимераза способна осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, используя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата. Ревертазы, как и ДНК-полимеразы действуют только при наличии затравки. Наиболее изучена ревертаза ретровирусов птиц.

Активность: ДНК-полимеразная – в качестве матрицы как ДНК, так и РНК

РНКаза Н – гидролизует РНК в составе гибрида РНК-ДНК (но не одиночную РНК)

ДНК-эндонуклеазная – для интеграции вирусной ДНК в геном клетки

Применение: транскрипция матричногй РНКв комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию проводят в присутствии сильных ингибиторов РНКазной активности.

Концевое включение метки в фрагменты ДНК с выступающими 5'-концами.

НУКЛЕАЗА BAL31

Активность: эндодезоксирибонуклеаза (экзонуклеаза) на двухцепочечной ДНК с тупыми или выступающими концами

эндодезоксирибонуклеаза на одноцепочечной ДНК

Для работы фермента необходим Са²⁺

Применение: 1)отщепление нуклеотидов с концов двухцепочечной ДНК. Укороченные молекулы могут быть присоединены к синтетическим линкерам или векторам

2) Картирование сайтов рестрикции в ДНК. При обработке ДНК ферментом в разные моменты времени отбирают пробы. Реакцию останавливают добавлением этиленгликоль тетрауксусной кислоты (избирательное связывание Са²⁺). После обработки проб рестриктазами можно наблюдать исчезновение рестриктов в определенном порядке.

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА: катализирует отщепление 5'-фосфатных остатков одно- или двухцепочечной ДНК, РНК, рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

5'рДНК → 5'_ОНДНК

5'рРНК → 5'_ОНРНК

Применение: 1. Отщепление 5'-фосфатов от ДНК или РНК перед включением 5'-концевого ³²Р.

2. Отщепление 5'-фосфатов от фрагментов ДНК для предотвращения сшивания концов одной молекулы

ТЕРМИНАЛЬНАЯ ТРАНСФЕРАЗА

Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза – катализирует присоединение дезоксинуклеотидов к 3'-ОН концу молекул ДНК.

Кофактор: Mg²⁺

Субстрат: одноцепочечная ДНК с 3'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим 3'-ОН концом

Кофактор: Со²⁺

Субстрат: двухцепочечная ДНК с тупыми концами или двухцепочечная ДНК с выступающим 5'-р концом