Активные формы кислорода и их генерация

Свободные радикалы, образующиеся в тканях животных.

В органических молекулах электроны на внешней электронной оболочке располагаются парами - одна пара на каждой орбитали. Свободные радикалы отличатся от обычных молекул тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный (одиночный) электрон. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремиться либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо отдать лишний электрон. В обоих случаях молекула – мишень модифицируется.

Согласно классификации, предложенной Владимировым Ю.А. большинство радикалов, образующихся в организме человека, можно разделить на природные и чужеродные (рис.1). Природные радикалы можно, в свою очередь, разделить на первичные (природные, табл 1), вторичные (повреждающие, табл 2) и третичные (радикалы антиоксидантов). Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем. Из первичного радикала – супероксида, а также в результате других процессов в организме могут образовываться весьма активные молекулярные соединения: пероксид водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, в первую очередь ионов Fe²⁺, из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры (см. табл.2.).

Перечисленные в табл.1 и 2 радикалы можно считать природными, поскольку они в определенном количестве всегда образуются в наших клетках. При действии ионизирующей и ультрафиолетовой радиации, а также при превращениях некоторых неприродных соединений, попавших в организм человека, в клетках и тканях также могут появляться радикалы.

Активные формы кислорода и их генерация

При рассмотрении курса «Биохимия человека» мы отмечали, что в обычном состоянии ткани человека расходуют ежеминутно около 200-280 мл кислорода. За сутки его потребляется порядка 300-400 л, что соответствует примерно 14-18 молям кислорода, а при тяжелой работе потребность в кислороде возрастает в десятки раз. Восстановление молекулярного кислорода связано с генерированием энергии в клетке, на что и используется основное его количество (95-98%). Относительно небольшая часть (2-5%) переходит в активные формы кислорода (Владимиров Ю.А. и др., 1991; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1993). Эти АФК затем частично используются для оксидативной модификации макромолекул. При отсутствии метаболизма средняя концентрация АФК в организме достигла бы 6 – 14 мМ. Однако реальный уровень их в тканях равен 10^-8мМ, т.е. в 10 ⁶ раз меньше (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1993).

Сам по себе молекулярный кислород не вступает в неконтролируемые химические реакции внутри организма (в основном состоянии он представляет собой триплет, имеет 2 неспаренных электрона с параллельными спинами, которые локализованы на различных орбиталях). Большинство органических молекул синглетны, их электроны обладают антипараллельными спинами, и вследствие различий в направлении спинов электронов взаимодействие органических молекул с молекулой кислорода протекает достаточно медленно.

Токсичные эффекты кислорода определяются не им самим, а разнообразными кислородными радикалами, которые образуются в тканях. Эти радикалы образуются в клетках как в результате нормальных метаболических реакций, так и вследствие нарушения их снабжения кислородом. Относительная доступность и легкость образования свободных радикалов (СР) в условиях неполного восстановления кислорода связана с уникальными свойствами его молекул. В химических соединениях атомы кислорода двухвалентны. Простейшей иллюстрацией этого является всем известная формула молекулы воды. Однако в молекуле кислорода оба атома соединены только одинарной связью, а остающийся на каждом атоме кислорода один электрон свободен. Основной устойчивой формой кислорода является так называемый триплетный кислород, в молекуле которого оба непарных электрона параллельны, но их спины (валентности) направлены в одну сторону. При разнонаправленном расположении спинов в молекуле образуется синглетный кислород, который по своим химическим свойствам является нестабильным и токсичным для биологических субстанций.

Некоторые клетки крови, а именно фагоциты, способны восстанавливать кислород с целью производства агентов, уничтожающих микроорганизмы. Фагоциты удаляют чужеродные клетки, например бактерии, поглощая и затем разрушая их, используя при этом как протеолитические ферменты, так и АФК. Во время стимуляции функционирования фагоцитов происходит вспышка их дыхательной активности, при этом потребление кислорода увеличивается примерно в 50 раз. В то же время глюкоза быстро метаболизируется через пентозофосфатный путь, что приводит к генерированию НАДФН. Мембраносвязанная НАДФН-оксидаза плазмы катализирует одноэлектронное восстановление кислорода путем переноса электронов от НАДФН к ФАД и затем, по-видимому, к цитохрому b, участвующему в восстановлении кислорода. Продукт этой реакции – свободный радикал, называемый супероксиданионрадикал, ·О₂^-.

НАДФН + 2О₂ ® НАДФ + 2 ·О₂^- + Н⁺

·О₂^- может самопроизвольно дисмутировать с образованием пероксида водорода, Н₂О₂; эти две формы кислорода представляют собой исходный материал для образования еще более токсичных соединений, таких, например, как гидроксильный радикал ОН^·. На рис. 1 представлена схема взаимопревращений названных АФК внутри клетки.

Небольшие количества АФК образуются как продукты окислительного метаболизма и в других типах клеток. Наибольший вклад вносит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой концентрации АДФ. Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети. Участвуют ядерная мембрана и другие части клетки, при этом АФК часто возникают не только спонтанно, но и ферментативно (НАДФН-оксидаза дыхательного взрыва в плазматической мембране и ксантиноксидаза в гиалоплазме). Таким образом, АФК генерируются во всех частях клетки. На заключительном этапе передачи электронов на кислород, осуществляемом цитохромоксидазой, в норме должно происходить восстановление молекулы кислорода до двух молекул воды за счет присоединения четырех электронов. В случае неполного восстановления кислорода при присоединении двух электронов образуется Н₂О₂; при присоединении одного электрона – супероксидный радикал. Концентрация АФК в тканях невысока. Так, концентрация супероксида в печени – около 10^-11М, а концентрация Н₂О₂ – примерно в 1000 раз выше, 10 ^–8М, НО^· - менее 10^-11М (Кулинский в.И., 1999). Изменение условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии) приводит к возрастанию возможности одноэлектронного восстановления кислорода, объясняющееся тем, что его сродство к убихинону выше, чем к цитохромоксидазе. Супероксиданионрадикал может образовываться и под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также путем взаимодействия кислорода с ионами металлов переменной валентности (чаще с железом) или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например, дофамина. Наконец, он может продуцироваться в клетках такими ферментами, как ксантиноксидаза или НАДФН-оксидаза.

Из первичного радикала – супероксида, а также в результате других реакций, в организме образуются весьма активные молекулярные соединения: пероксид водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Такие молекулы, наряду с радикалами, получили в англоязычной литературе название “reactive species”, что в русской литературе чаще всего переводится как «активные формы». Чтобы провести черту между радикалами и молекулярными продуктами, некоторые ученые предлагают называть последние «реактивными молекулами». Таким образом, исходя из этого, можно сказать, что активные формы – это свободные радикалы + реактивные молекулы. Напомним, что свободные радикалы – молекулярные частицы, имеющие неспаренный электрон на внешней электронной оболочке.

Термин АФК шире, чем «свободные радикалы кислорода», т.к. кроме последних включает также молекулы Н₂О₂, синглетный кислород ¹О₂, озон О₃, гипохлорит ОСl^-. К АФК относятся также супероксид, радикал гидроксила ОН^·. К активным формам может быть отнесен и NO- радикал.

Некоторые авторы предлагают такие термины как активные формы азота и хлора. Окись азота и результат ее взаимодействия с супероксидом – пероксинитрит, предлагается называть активными формами азота. Активной формой хлора можно назвать гипохлорит, образуемый в реакции пероксида водорода с ионом хлорида, катализируемой ферментом миелопероксидазой.

Очевидно, определенное место в складывающейся терминологии должны занимать радикалы и гидроксипероксиды полиненасыщенных жирных кислот, образующиеся в ходе цепного окисления липидов. С химической точки зрения – это неоднородная группа. При отрыве атома водорода от молекулы полинасыщенной????? жирной кислоты образуется алкильный радикал, в котором неспаренный электрон локализован у углеродного атома. Это как бы «активная форма углерода». Но при дальнейшем взаимодействии алкильного радикала с молекулрным кислород (т.е. диоксигеном) образуется диоксид-радикал с локализацией неспаренного электрона на атоме кислорода. По структуре и, отчасти, по свойствам такой радикал напоминает супероксид, и его можно отнести к активным формам кислорода, что и делают некоторые авторы. Образующиеся при пероксидном окислении липидов (ПОЛ) гидроперекиси насыщенных жирных кислот также можно отнести к этой категории активных форм, по аналогии с пероксидом водорода. В эту же категорию попадают тогда и аллоксильные радикалы липидов, образующиеся при одноэлектронном восстановлении гидроперекисей, например, ионами Fe²⁺; по сути, это гомологи гидроксильного радиала.

Несмотря на сказанное большинство ученых склонны к объединению всех перечисленных продуктов (и реагентов) цепного окисления липидов. Для биолога и врача все же важнее, не у какого именно атома локализован неспаренный электрон, а какая молекула при этом становится химически агрессивной, т.е. приобретает черты свободного радикала или его реактивного предшественника. Итак, к активным формам липидов можно отнести алкильные, аллоксильные и диоксид-радикалы, а также гидроперекиси полинасыщенных????? жирных кислот и соответствующих цепей фосфолипидов или холестерина.