Метод заключается в непосредственном взаимодействии антигена и антител, когда один из них сорбирован на твердой фазе, а другой мечен ферментом.
В настоящем разделе будет дан новый вариант ИФА, тогда как известные варианты широко описаны в литературе.
ИФАП - иммуноферментный анализ прямой.
В лунки полистироловых планшет, например, Санкт-Петербургского зав. биополимеров или другого производства, вносят растворимый на антиген материал по 0,1 мл в дозе 0,05 мкг на 1 мл и планшет оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Планшет отмывают растворителем (0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 0,2 % твина-20, рН 7,2) от несвязавшегося материала.
Предварительно готовят конъюгат: к раствору глобулина иммунной сыворотки, которая должна быть гомологичной предполагаемому антигену по специфичности, в дозе 5 мг на мл, добавляют равный объем раствора каталазы в дозе 10 мг на мл и 0,1 % от объема смеси 2,5 % глутарового альдегида. Смесь выдерживают 30 мин при 37о С, осаждают глобулин 40 % раствором сульфата аммония, растворяют малым объемом растворителя и освобождаются от солей аммония, пропуская глобулин через колонку с сефадексом G-50. Готовый конъюгат хранят с 0,05 % азида натрия или лиофилизируют.
|
|
Во все лунки с материалом вносят конъюгат по 0,1 мл и смесь оставляют на 60 мин, после чего трижды промывают растворителем.
Для проявления взаимодействия антигена с антителом необходимо выявить в лунках каталазу. Для этого, вносят субстрат - перекись водорода (0,015 % по 0,1 мл) и через 15 мин вносят хромоген, для проявления реакции каталазы с субстратом - 1 % раствор перманганата калия. Результат реакции оценивают по появлению окрашивания. Если в исследуемом материале есть антиген, то с ним взаимодействуют антитела, которые мечены ферментом. Добавленная перекись водорода разрушается каталазой на воду и атомарный кислород и вносимый хромоген проявляет эту реакцию - жидкость остается красного цвета. Если антигена не было, то антител также не будет как и каталазы. Перекись водорода остается неразрушенной и добавленный перманганат калия моментально меняет цвет на желтый, сходный с контрольной лункой.
Непрямой метод.
ИФА - иммуноферментный анализ.
Существуем много вариантов постановки ИФА, в том числе - твердофазных, на одном из них мы и остановимся.
В микропланшеты вносят по 0,1 мл раствора известного растворимого антигена в дозе 0,05 мкг на мл. Планшеты оставляют на 24 ч при комнатной температуре, трижды отмывают растворителем.
Делают несколько последовательных разведений исследуемой иммунной сыворотки в пробирках в объеме 0,5 мл, начиная с 1:50. Последней пробиркой является контрольная – без сыворотки. Начиная с контроля, вносят в последнюю лунку планшета 0,1 мл (контроль), в предпоследнюю лунку планшета - 0,1 мл разведения из предпоследней пробирки и т.д. Смесь оставляют на 30 мин при 37о С и затем трижды промывают лунки растворителем. После этого вносят во все лунки видовой конъюгат по 0,1 мл Смесь выдерживают 40 мин при комнатной температуре и трижды промывают растворителем. А затем вносят субстрат и хромоген.
|
|
Предварительно делают конъюгат, как описано выше, только в качестве сыворотки берут кроличью антисыворотку к сывороточным белкам человека, которую метят ферментом каталазой (как описано выше). Получаем видовой конъюгат против белков сыворотки людей. Применение такого препарата более выгодно, чем на основе гомологичной иммунной сыворотки к антигену. Такую сыворотку необходимо готовить заново при новом антигене, а видовой конъюгат можно использовать во всех случаях исследования сывороток людей.
Если исследуемая сыворотка содержала антитела, то происходит взаимодействие ее с антигеном и на Fc-фрагмент ее антител прикрепляются антитела из конъюгата (кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека) меченого ферментом. Он разлагает внесенный в лунки субстрат и хромоген (перманганат калия) не изменит своего красного цвета. Если антител в сыворотке исследуемой нет, то не будет и фермента и субстрат будет действовать на хромоген, который мгновенно изменит цвет среды на желтый (таблица № 24).
Таблица № 24.
Схема постановки непрямого варианта ИФА
Лунки планшет | Последовательность процесса постановки непрямого варианта ИФА | ||||||||||
антиген | процесс отмывания | антисы- воротка | процесс отмывания | конъю- гат | субстрат | хромоген | резуль- тат ИФА | ||||
Дополнительная характеристика вносимых агентов, в мг или мл | |||||||||||
в рабо-чей дозе | фосфатн. буфер + твин-20 | - 1:100 или раствори-тель | то же | на 30 мин | перекись водорода на 15 мин | перманга-нат калия | окраска, момен- тально | ||||
1-я. Опыт | 0,05 мл | 3 раза | 0,025 мл | 3 раза | 0,05 мл | 0,05 мл | 0,05 мл | красная | |||
2-я. Контроль | 0,05 мл | 3 раза | растворитель по 0,025 мл | 3 раза | 0,05 мл | 0,05 мл | 0,05 мл | желтая | |||