Разрешение хроматографических пиков и эффективность колонки

Фактор разделения (α) не описывает качество разделительного процесса. Разрешение двух хроматографических пиков (R_s) принимает во внимание не только места их расположения, но и учитывает величины ширины пиков w₁ и w₂:

(1)

Если различие времен удерживания двух пиков сравнительно большое, а ширина оснований (w₁ + w₂) мала, тогда разрешение пиков хорошее. Два вещества могут быть идентифицированы, если для них R_s = 0,5. Для удовлетворительного разделения R_s должно быть равно 1 (4σ – разделение; 4σ – ширина основания гауссового пика). При выполнении количественного анализа стремятся к разрешениям R_s от 1,2 до 1,5. Величины R_s ≥ 2 (8σ – разрешение) следует избегать из-за большой продолжительности анализа.

Немаловажным фактором в хроматографии является эффективность хроматографической системы. Под эффективностью понимают её способность препятствовать размыванию пиков. Для объяснения такого процесса используют теорию теоретических тарелок и кинетическую теорию.

Теория теоретических тарелок, общая для всех многостадийных процессов (например, противоточная экстракция), впервые была предложена для описания процесса дистилляции. Мартин и Синдж распространили ее на хроматографические системы. Теория основана на некоторых допущениях:

1) колонка состоит из определенного числа теоретических тарелок;

2) равновесие на каждой тарелке считается достигнутым до того, как подвижная фаза переместится на следующую тарелку, т.е. равновесие устанавливается мгновенно;

3) на любой тарелке в любой момент времени число молекул (ионов) сорбируемых компонентов пробы значительно меньше, чем число сорбируемых молекул (ионов) элюента, т.е. вводимая проба должна быть малой, а изотерма — линейной;

4) все протекающие в колонке процессы рассматриваются как взаимно независимые.

Теоретическая тарелка – это гипотетическая зона, высота которой соответствует достижению равновесного состояния между двумя фазами. Чем больше теоретических тарелок в колонке, т.е. чем больше число раз устанавливается равновесие, тем эффективнее колонка.

Эффективность колонки — это характеристика качества колонки, определяемая числом теоретических тарелок и высотой теоретической тарелки. Так как хроматографический процесс непрерывен и неравновесен, то представление о теоретической тарелке в хроматографии имеет умозрительный, формальный характер. Эта теория позволяет описать движение зоны с максимальной концентрацией компонента, экспериментально оценить ширину полосы (степень размывания хроматографической полосы) и эффективность колонки. Она дает математическую модель продвижения полосы компонента через колонку, из которой следует, что элюированная полоса имеет форму и ширину нормального распределения Гаусса.

Количественной мерой эффективности является число теоретических тарелок N и высота Н, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ):

N = (t_R / σ)² = 16·(t_R / w_осн.)² = 5,54·(t_R / w_0,5)² (2)

H = L / N, (3)

где L – длина колонки.

В случае высокоэффективной колонки размывание хроматографического пика небольшое, пики узкие. В идеальном случае Н приближается к диаметру (d) зерна сорбента. Чтобы сравнить эффективность двух колонок, лучше использовать приведенную высоту тарелки: h = H/d. При уменьшении величины Н максимумы хроматографических пиков становятся более острыми.

Таким образом, теория теоретических тарелок дает возможность сравнить эффективность различных колонок, оценить качество сорбента и заполнения колонок. Однако эта теория не позволяет выяснить зависимость N и Н от скорости потока элюента, природы и зернения сорбента. Кроме того, не позволяет выяснить природу факторов, вызывающих размывание.

Кинетическая теория хроматографии

Вещества вводятся в колонку в виде узкой зоны, которая по мере ее движения с подвижной фазой по колонке становится все шире, т. е. размывается в результате диффузионных процессов. Мерой этого размывания в колонке является высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Установлено, что размывание полосы в хроматографической колонке обусловлено тремя причинами: наличием вихревой диффузии, молекулярной диффузии и сопротивления массопередаче.

Кинетическая теория хроматографии объясняет размывание хроматографических пиков, главным образом, этими тремя независимыми процессами, вклад каждого из которых описывается уравнением Ван-Деемтера:

H = A + B / ν + C·ν, (4)

где А, B / ν, C·ν – члены, учитывающие соответственно: неравномерность движения потока элюента (вихревая диффузия), молекулярную диффузию и отклонение от сорбционного равновесия (сопротивление массопереносу; ν – линейная скорость потока).

Чем меньше каждое из трех слагаемых, тем меньше будет и суммарное значение ВЭТТ и, следовательно, эффективнее колонка.

Вихревая диффузия – следствие изменения линейной скорости потока подвижной фазы по сравнению с ее средним значением. Величина А зависит от структуры сорбента (наличие капиллярных полостей между частицами сорбента) и изменения по длине колонки:

A = 2λd, (5)

где λ – коэффициент гомогенности упаковки колонки (как правило,
λ = 0,1 – 0,8); d – диаметр частиц сорбента. Величина А пропорциональна диаметру частиц сорбента и уменьшается с улучшением равномерности заполнения колонки сорбентом.

Плохая упаковка и каналообразование приводят к увеличению λ, а следовательно, к уширению полосы за счет вихревой диффузии. Для уменьшения размывания полосы необходимо равномерно заполнять колонку мелкими и по возможности однородными по дисперсности частицами.

Вихревая диффузия имеет место только в насадочных колонках. Общий поток элюента при попадании в колонку распадается на отдельные потоки между зернами. Микропотоки двигаются с разными скоростями. Это приводит к дополнительному размыванию.

Молекулярная (продольная) диффузия B/ν обусловлена миграцией молекул, главным образом, в подвижной фазе и участков полосы с большей концентрацией в направлении, где концентрация меньше:

B=2γD_п.ф., (6)

γ— коэффициент, учитывающий ограничение диффузии сорбентом колонки (γ < 1); D_п.ф. – коэффициент диффузии вещества в подвижной фазе.

Величина В растет при использовании очень малых скоростей потока. При обычно используемых высоких скоростях В настолько мала, что ею можно пренебречь. Поэтому эффективность колонки возрастает (Н уменьшается) при использовании подвижных фаз, в которых коэффициенты диффузии низки, и высокой линейной скорости потока.

Параметр Cν учитывает сопротивление массопереносу при непрерывном переходе вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно. Характеризует скорость распределения вещества межу двумя фазами.

. (7)

Величина Cν уменьшается при уменьшении размера частиц (пропорционально квадрату диаметра частиц), более равномерном и плотном заполнении колонки сорбентом, менее вязком растворителе, меньших скоростях потока.

Если изобразить графически зависимость ВЭТТ от скорости подачи элюента, то она будет иметь вид, изображенный на рис. 1. На нем можно видеть и оценить вклад каждой из составляющих в величину ВЭТТ.

Рисунок 1. Зависимость ВЭТТ от скорости потока элюента. Вклад в размывание пика разных факторов.

Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эффективность повышается, когда применяется более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев неподвижной фазы, менее вязких подвижных фаз и оптимальных скоростей потока.