Методы определения активности микроорганизмов и продуктов их метаболизма

Рассмотрим методы определения метаболической активности микроорганизмов на примере участвующих в биобрастании аэробных и анаэробных бактерий под действием биоцидов.

На сегодняшний день существует только один стандартизированный количественный метод оценки устойчивости материалов к воз­действию бактерий. Его суть заключается в инкубировании аэробных бактерий на поверх­ности образца биозащищенного материала в течение определенного времени с последую­щим смывом и определением числа сохранив­ших жизнеспособность клеток.

Однако, реализация этого метода с опыт­ными образцами показала, что данные мате­риалы обладают очень развитой пористой по­верхностью и хорошими адсорбционными свойствами, в результате, сохранившие жизне­способность клетки остаются адсорбировав­шимися на поверхности образца и не образуют колонии при высеве. Таким образом, возникает существенная погрешность в определении кон­центрации выживших клеток, что делает дан­ный метод непригодным для достижения указанных целей.

В то же время, известны подходы к опреде­лению степени биозащищенности материалов, основанные на сопоставлении метаболической активности прикрепленных к поверхности об­разца бактерий. Эти методы обладают преиму­ществами при анализе антимикробных свойств пористых материалов с развитой поверхностью.

Для оценки метаболической активности анаэробных бактерий разработан количествен­ный анаэробно–суспензионный метод оценки устойчивости материаловканаэробной био­коррозии. В качестве тест-культур в нем используются облигатно анаэробные сульфат­редуцирующие бактерии, осуществляющие специфический способ запасания энергии – сульфатное дыхание, при котором происходит диссимиляционное восстановление соединений серы с образованием сероводорода и сульфидов. Суть этого метода заключается в определе­нии содержания сероводорода в культуральной жидкости после совместного инкубирования сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) с об­разцом в среде, не содержащей ионов железа, в специальном анаэробном биореакторе. Регист­рацию количества сероводорода проводят фо- токолориметрически на основе цветной реак­цииобразования метиленового синего. Схематически данный анализ представлен на рисунке 2.

Рисунок 2 – Схема анаэробно-суспензионного метода определения антибактериальных свойств биозащищенных материалов

Проверку полученных в результате анализа результатов можно осуществлять при помощи стандартного каче­ственного метода, основанного на инкуби­ровании СРБ в питательной среде, содержащей железо, с последующей визуальной регистрирацией образования черных зон сульфида, ко­торые и учитываются при оценке бактерио- стойкости по трехбалльной шкале.

Для оценки антибактериальных свойств образцов биозащищенного материала по от­ношению к аэробным бактериям Pseudomonas fluoresceins был разработан метод оценки дыхательной активности клеток.

Для этого необходимо провести совместное инкубирова­ние культуры бактерий, находящейся в log-фазе роста, с опытными образцами в течение суток. Для ин­тенсификации дыхательного процесса необходимо создать благоприятные условия, помес­тив данную суспензию с образцом в свежий питательный бульон с последующим динами­ческим измерением в нем остаточного содержания растворенного молекулярного кислорода. Схема данного анализа приведена на рисунке 3.

Рисунок 3 – Схема метода определения дыхательной активности бактерии

В основу принципа измерения положен амперометрический метод анализа. На рисунке 4, представленном ниже, отображены графики зависимости содержания кислорода в культуральных жидкостях от длительности процесса дыхания.

Рисунок 4 –Динамика изменения содержания кислорода в культуральной жидкости

Чтобы повысить разрешающую способ­ность метода, в качестве основного показателя антимикробных свойств образцов используется скорость потребления кислорода К, мг/л·мин:

К = ∆С / ∆t, (1)

где ∆С – изменение концентрации кислорода за время ∆t, мг/л;

∆t – время измерения, мин.

Описанные методы позволяют получить схожие результаты и демонстрируют зависимость между концентрацией биоцида в составе материала и его ус­тойчивостью к биообрастанию: чем больше концентрация биоцида, тем большей бактериостойкостью характеризуется материал.

Описанные количественные методы, основанные на измерении метаболической активности аэроб­ных и анаэробных бактерий являются более объективными по сравнению со стандарт­ными методами для оценки устойчивости к биообрастанию образцов биозащищенных ма­териалов. Результаты анаэробно-суспензион­ного метода и метода определения дыхательной активности аэробных бактерий рода P. fluorescens коррелируют между собой, что дает осно­вание судить о сходной чувствительности к биоцидным добавкам наиболее распространен­ных аэробных и анаэробных бактерий, участ­вующих в биобрастании [13].