Объект исследования

Из анализа литературы следует, что большая доля экспериментов по исследованию механизмов обонятельной трансдукции проводится на изолированных обонятельных клетках. Это дает возможность быть уверенным в том, что реакции в ответ на одоранты регистрируются именно в них. Однако одним из последствий способа получения изолированных клеток является разрушение плотных контактов между ними, что вызывает в дальнейшем перераспределение белковых молекул по клеточной поверхности и ошибочным выводам из получаемых результатов у разных авторов (Frings et al., 1991).

Наши исследования проводились на изолированной обонятельной выстилке осенне-зимних лягушек (Rana temporaria), обитающих в Ленинградской области. Исследование ольфакторных рецепторов в составе обонятельной выстилки имеет ряд преимуществ. В условиях in situ изучение эффектов химической стимуляции на рецепторных клетках осуществляется при сохранении их естественного расположения в обонятельном эпителии и целостности межклеточных контактов. Кроме того, в этих условиях эксперимента сохраняются опорные клетки, которые, как известно, обеспечивают рецепторным клеткам важные гомеостатические функции (Frings, Lindemann, 1991; Zhang et al., 2000). В составе выстилки обонятельные клетки не повреждаются энзимами или низким содержанием ионов кальция, а также инвазивными регистрирующими процедурами и имеют более высокую чувствительность к одорантам, чем изолированные (Frings et al., 1991; Frings, Lindemann, 1988; Frings et al., 1992).

Периферическая часть обонятельного анализатора у лягушек в виде особого возвышения располагается на дне главной полости и выстлана обонятельным эпителием, который по цвету отличается от окружающей ткани, имея оранжево-желтую, а не розовую окраску. Поэтому его легко обнаруживать. Препарат изолированной выстилки готовили следующим образом. Животному разрушали спинной и головной мозг, отрезали верхнюю челюсть на уровне глаз и снимали кожу. Затем разрезали крышу носовой полости и обнажали обонятельный бугорок, который изолировали вместе с подлежащей хрящевой тканью. В таком виде проводили его прижизненную люминесцентную микроскопию. Для этого изолированную обонятельную выстилку помещали на предметное стекло, фиксировали таким образом, чтобы поверхность ольфакторного эпителия была доступна для обдувания ее воздушной струей, содержащей одоранты, и для протока применяемых растворов.

В опытах с прижизненной телевизионной и флуоресцентной сканирующей микроскопией использовали тонкие срезы обонятельного эпителия. С этой целью скальпелем выстилку отделяли от хрящевой основы и резали на кусочки, которые помещали в каплю раствора Рингера для холоднокровных и фиксировали покровным стеклом. Растворы одорантов и фармакологических препаратов вводили в проток.