Методы определения общего белка крови

Методы определения общего белка в сыворотке крови основаны на различных принципах:

· спектрофотометрические – на определении поглощения при 280 нм,

· фотометрические – на измерении окрашенных продуктов реакции,

· рефрактометрические – на определении коэффициентов рефракции или преломления света.

Наиболее распространены рефрактометрические и фотометрические биуретовые методы. В биуретовой реакции атом меди связывает атомы азота белка с образованием цветных соединений.

Принцип метода: пептидные связи белка с солями меди в щелочной среде образуют комплекс фиолетового цвета (биуретовая реакция).

Реактивы:

1. Хлорид натрия: 9 г в 1 л. воды.

2. Натр едкий: 8 г. На 1 литр воды.

3. Калий иодид: 30 ммоль/л раствор иодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натрия; 0,5 г иодида калия помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки 0,2 мол/л раствором едкого натра.

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль).

5. Сульфат меди 5-ти водный.

6. Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла

7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5% раствора йодида калия. Раствор стабилен.

8. Калибровочный раствор альбумина: 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия.

Ход определения: Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают. Через 30 мин измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм, (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу. Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора 10% альбумина готовят разведения. Берут 0,2 мл; 0,4 мл; 0,6 мл; 0,8 мл; 1,0 мл доводят раствором хлорида натрия соответственно каждую до 1 мл. Концентрация в первой пробирке равна 20 г/л альбумина, во второй - 40 г/л, в третьей - 30 г/л, в четвертой - 80 г/л, в пятой - 100 г/л. Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30- 60 мин измеряют на фотометре, как в опыте, против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график.

Нормальные величины: 65-85 г/л (6,5-8,5 г/100 мл).