Определение активности амилазы

Амилаза катализирует 1,4- гликозидные связи крахмала, гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы, декстринов и других полимеров. У человека амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в тканях печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса ее низкая, равна 48 000 Да, в отличие от большинства ферментов она фильтруется в клубочках почек и содержится в моче. Амилаза состоит из двух изоферментов: панкреатического и слюнного. У здоровых людей в сыворотке крови около 70% амилолитической активности приходится на слюнной изофермент, в моче приблизительно такой же процент приходится на панкреатическую изоамилазу.

Гиперамилаземия наблюдается при многих заболеваниях, но наиболее выражена при остром панкреатите, при котором активность увеличивается за счет панкреатического изофермента. При данном заболевании наибольший подъем содержания амилазы в крови отмечается в первые сутки.

В качестве субстрата в методах определения амилазы чаще применяют крахмал. Крахмал - полисахарид, состоящий из 10-20% из амилозы и амилопектина, нерастворимого в воде. Активность фермента возрастает в присутствии ионов хлора.. в молекулу амилазы входит атом кальция. Ионы кальция не только активируют амилазу, но и предохраняют ее от потери активности и распада под влиянием протеолитических ферментов.

Ингибирование активности амилазы фторидами, цитратом, оксалатом и ЭДТА объясняется связыванием ионов кальция. Унифицированным методом является метод Смита-Роя и Каравея.

Принцип метода: амилаза гидролизует расщепление крахмала с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Реактивы:

1. Бензойная кислота.

2. Натрия фосфат двузамещенный безводный (Na₂HРО₄).

3. Крахмал растворимый.

4. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

5. Субстратно-буферный раствор рН 7,0: 13,3 г Na₂HРО₄ и 2 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл 0,154 моль/л хлорида натрия и доводят до кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крахмала в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипящий буферный раствор. Кипятят 1 мин. Охлаждают и доводят водой до 500 мл.

6. Калия йодит.

7. Калий йодноватокислый.

8. Калия фторид.

9. НCI концентрированная.

10. 0,01 Н раствор йода: 0,036 г йодноватокислого калия и 0, 45 г йодида калия растворяют в 40 мл воды и медленно при помешивании добавляют 0,09 мл концентрированной НСI. 5 г фторида калия растворяют в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, приливают 40 мл раствора йода и доливают водой до 100 мл.

Ход определения: Опытная проба: 0, 5 мл субстратно-буферного раствора помещают в пробирку, нагревают 5 минут при 37 °С, добавляют 0,01 мл сыворотки. Инкубируют 7,5 мин при 37 °С. После инкубации добавляют 0,5 мл 0,1 н раствора йода и доводят объем водой до 5 мл. Измеряют на ФЭК в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) против воды.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, сыворотку добавляют после инкубации вместе с 0, 1 н раствором йода. Измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу, против воды.

Активность амилазы выражают в миллиграммах или граммах крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37 °С. Расчет производят по формуле:

Активность амилазы, мг/с.л. = Е1 - Е2,

где Е1 – экстинкция холостой пробы,

Е2 - экстинкция опытной пробы,

С- количество крахмала, введенного в опытную и холостую пробы,

t – коэффициент пересчета на 1 с инкубации,

К – коэффициент пересчета на 1 л биологической жидкости с учетом разведения.

Нормальные величины. Сыворотка крови: 3,3-8,9 мг/с.л или 120 мг/ч.мл.