Метод определения щелочной фосфатазы (ЩФ)

Фосфатазы – ферменты, гидролизующие эфиры фосфорной кислоты. В зависимости от значения рН, при котором действует фермент, различают щелочную и кислую фосфатазу. Щелочная фосфатаза (ЩФ) содержится практически во всех животных тканях, но наиболее богаты ферментом печень, костная ткань, кишечник, плацента. ЩФ - негомогенный фермент: различают 5 тканево-специфических изоферментов ЩФ: плацентарный, костный, печеночный, кишечный, почечный. Множественные формы ЩФ обусловлены как генетическими факторами, так и пострансляционной модификацией. Для плацентарной формы существует отдельный генетический локус и аллельные варианты, которые не обнаруживаются для других изоформ. Фракции ЩФ различаются по своим каталитическим свойствам, электрофоретической подвижности, устойчивости к тепловой инактивации.

В норме при электрофорезе выявляется 1-2 фракции ЩФ в зоне α2-глобулинов. При патологии количество изоферментов и их расположение при электрофорезе могут меняться. ЩФ образует комплексы с белками и липидами.

Методы определенияфосфатаз различаются по используемому субстрату: В- глицерофосфат, фенилфосфат натрия, п-нитрофенилфосфат натрия. Однако наибольшие преимущества имеет использование п-нитрофенилфосфата, который легко гидролизуется и дает минимальные различия для изоферментов ЩФ.

Принцип метода: субстрат п-нитрофенилфосфата натрия гидролизуется с образованием п-нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание.

Реактивы:

1. п-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты динатриевая соль.

2. НСI, 0,001 моль/л.

3. п-нитрофенилфосфат натрия, 4 г помещают в колбу на 100 мл и доливают до метки 0, 001 моль/л раствором НСI.

4. Аминоуксусная кислота.

5. Магния хлорид 6-водный.

6. Натр едкий

7. Буферный раствор –0,05 моль/л глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния – 95 мг/л; 375 мг глицина и 10 мг MgCl₂ х 6Н₂О растворяют в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5.

9. п-нитрофенол – калибровочный раствор: 696 мг п-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.

Ход определения: Опытная проба: в пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного раствора, прогревают при 37 °С в течение 5 мин, затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37 °С. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со льдом, а затем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 мин пробы измеряют на ФЭК при длине волны 400- 420 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет производят по калибровочному графику.

Для его построения готовят ряд разведений и измеряют оптическую плотность при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/л раствора едкого натра.

В 5 пробирок соответственно добавляют по 1 мл, 2 мл, 3 мл, 5 мл, 7 мл калибровочного раствора. Содержание п-нитрофенола в них соответствует: 0,05 мкмоль; 0,1 мкмоль; 0,15 мкмоль; 0,25 мкмоль; 0,35 мкмоль. В пробирки добавляют с первой по пятую: 10,1 мл; 9,1 мл; 8,1 мл; 6,1 мл; 4,1 мл раствора 0,02 моль/л NaOH. Активность ЩФ в пробирках с первой по пятую составляет: 278 нмоль/л; 556 нмоль/л; 834 нмоль/л; 1390 нмоль/л; 1946 нмоль/л.

Нормальные величины: 278-830 нмоль /с.л.