В электрохимических биосенсорах

Стабильность аналитических систем на основе иммобилизованных ферментов определяется в основном устойчивостью биокатализаторов. Многие клеточные ферменты, однако, являются весьма лабильными и неустойчивыми белками. Аналитические системы, созданные на основе этих биокатализаторов, обладают непродолжительным временем действия. Интактные клетки микроорганизмов содержат все ферментативные системы, необходимые для их жизнедеятельности. Они с высокой эффективностью преобразуют химическую и другие формы энергии, обладают необходимой стабильностью и регенеративностью. В клетках происходят превращения субстрата под действием полиферментных комплексов и систем, в которых участвуют коферменты. В связи с этим представляет интерес разработка методов, позволяющих сопрягать в аналитических системах клеточные ферментативные реакции с электродными процессами.

Существует ряд принципиальных возможностей использования микроорганизмов для аналитических целей. Вещества, влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов, могут привести к изменению скорости выделения тепла или другой функции, например скорости дыхания, генерации мембранного потенциала и т. д. В других случаях индуцируется определенная ферментативная система, которая в клетках микроорганизмов может действовать подобно ферменту в микрокапсулах. Специфичность такого микро-реактора определяется ферментативной реакцией и проницаемостью клеточных мембран. В электрохимических микробных биосенсорах клетки микроорганизмов захватываются на поверхности потенциометрических (ионоселективных или газовых) или амперометрических электродов. Под действием определенных ферментативных систем клеток субстраты трансформируются в продукты, которые и определяются электрохимическим датчиком, либо определение ведется по скорости потребления кислорода.

В селективном относительно аргинина биосенсоре применены клетки микроорганизмов Streptococcus faecium,которые широко используются для микробиологического определения аминокислот. В клетках микроорганизмов L-аргинин превращается в ионы аммония под действием следующих ферментативных реакций:

аргининдеаминаза

аргинин цитруллин + NH₃

орнитинтранскарбомилаза

цитруллин+H₃PO₄ орнитин+карбамоилфосфат

карбамоилаткиназа

карбамоилфосфат+АДФ карбамоиловая к-та+АТФ

карбамоиловая к-та ® СО₂ + NH₃.

Ионы аммония в больших количествах образуются только из аргинина, поэтому можно ожидать высокой селективности биосенсора относительно этой аминокислоты. Внеклеточный цитруллин не дает ионов аммония, так как клеточные мембраны для него непроницаемы.

Преимуществом бактериальных биосенсоров является возможность их регенерации. После 20-дневной эксплуатации и выдерживания в питательной среде в течение 2 суток, биосенсоры полностью восстанавливают свои параметры.

Чувствительный к аспартату биосенсор изготовлен на основе клеток Bacterium cadaveris и газового NH₃ -электрода. В клетках микроорганизмов аспартат метаболизируется следующим образом:

аспартаза

аспартат фумарат + NH₃.

Аспартаза – весьма нестабильный фермент. Электрод, изготовленный на основе очищенного фермента, инактивируется в течение 1 суток. Добавлением дитиотреитола к среде хранения бактериального электрода можно увеличить время его службы до 10 суток. Стабильность этого биосенсора значительно возрастает при выдерживании его в питательной среде, в которой ферментный электрод не восстанавливается. Эти данные свидетельствуют о регенерируемости бактериальных биосенсоров.

Наличие в большинстве клеток микроорганизмов деаминаз аминокислот и других органических соединений сильно уменьшает селективность микробных сенсоров на основе аммонийного электрода. Однако замена аммиачного датчика на другой иногда позволяет обойти этот недостаток. Например, с использованием бактерий Proteus morganium, которые катализируют превращение цистеина, и газового H₂S -электрода изготовлен селективный биосенсор для определения цистеина:

цистеиндесульфгидраза

цистеин пируват + NH₃ + H₂S.

Облигатные или факультативные аэробные микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности потребляют кислород. Это их свойство использовано при создании ряда микробных сенсоров для определения концентрации органических соединений, биологическое окисление которых протекает с потреблением кислорода. Кроме того, так называемая биохимическая потребность в кислороде является параметром, характеризующим степень загрязнения воды органическими соединениями. Таким образом, биосенсоры, основанные на явлении потребления кислорода микроорганизмами, могут использоваться как для определения содержания конкретных веществ (в этом случае используются определенные бактерии или отдельные штаммы их), так и для контроля качества воды (по потреблению кислорода, обусловленному наличием целого ряда различных органических соединений).

4.3.. Физико-химические основы регистрации иммунных реакций электрохимическими