Субстратом или продуктом, н, fio-вторых, процесс должен быть диффузионно-контролируемым

Аллостерические и кооперативные свойства иммобилизован­ных олигомерных ферментов. Выше были рассмотрены в основ­ном те ферменты, кинетика действия которых подчиняется урав­нению Михаэлиеа - - Ментен. Однако в природе наиболее распро­страненными являются аллостерические ферменты. Основная особенность этих ферментов состоит в том, что регуляция их активtfости под действием субстратов, продуктов н других мета­болитов клетки осуществляется по кооперативному механизму (подробно об этом явлении и его кинетическом описании см. в монографии Б. И. Курганова «Аллостерические ферменты»,

1978).

В настоящее время не вызывает сомненкя, что решающая роль в механизме кооперативной регуляции активности при­надлежит коиформационной подвижности белков. Поскольку иммобилизация иногда существенно ограничивает ее, то коопе­ративные и аллостерические свойства олигомерных ферментов в иммобилизованном состояния часто отличаются от свойств этих ферментов в гомогенном растворе. При этом иногда умень­шается или даже совсем исчезает S-образный характер зависи­мости скорости реакции от концентрации субстрата или аллостери-ческого лиганда, Эти зависимости могут трансформироваться в сигмондальные, которые характерны для ферментов, действую­щих в соответствии с кинетическим уравнением Михазлиса — Ментен.

Иммобилизованные полиферментные системы. В последние годы получено немало доказательств того, что многие ферменты в клетках работают в виде структурно и кинетически единых комплексов. В них проходит цепь последовательных процессов, когда продукт первого "фермента является субстратом для второ­го фермента и т. д. В поли ферментных комплексах активность каждой компоненты, как правило, превышает активность изо­лированного фермента в гомогенном растворе. Основная причина этого заключается в том, что в комплексе за счет простран­ственного сближения и диффузионных ограничений могут ло­кально концентрироваться промежуточные соединения: суб­страты, активаторы, ингибиторы. Эффекта локального концентри­рования удается добиться при иммобилизации нескольких фер­ментов вместе на одном носителе.

Первая искусственная биферментная система, основанная на иммобилизованных ферментах, была создана К. Мосбахом (1970). Гексокиназу и глюкозо-6 фосфатдегидрогеназу ко-валентно присоединяли к носителю; они последовательно пере­рабатывали глюкозу в глюкозо-6-лактон-б-фосфат. По сравнению с системой двух ферментов в растворе эффективность возросла на 40— 140%; при этом исчезал индукционный период в актив­ности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (второго фермента в по­следовательности).

М7

К настоящему времени описано несколько десятков и «моби­лизационных систем, в которых согласованно действуют два, три, четыре и большее число ферментов. Все они выигрывают в эффективности по сравнению с ферментами в растворе за счет того, что вблизи активного центра второго (третьего и т. д,) фермента очень быстро достигается стационарная концентрация его субстрата.

Иммобилизованные органеллы и клетки. Иногда ферменты используют, не выделяя их из нативного микроокружения in vivo_y з в виде целых клеток или субклеточных структур — митохондрий, хлоропластов и т. п. Такая форма биокатализато­ров имеет целый ряд преимуществ. Перечислим наиболее важ­ные из них: сохранность природного микроокружения (которое, как правило, обеспечивает ферментам повышенную стабиль­ность) и способность воспроизводить ферменты природным путем при использовании варианта растущих клеток.

Для придания органеллам или клеткам большей технологич­ности их иммобилизуют. Кинетическое описание катализа под действием иммобилизованных клеток представляет очень сложную проблему. Здесь необходимо учитывать последовательную цепь диффузионных и кинетических процессов, осложненных эффек­тами распределения метаболитов и их активного транспорта (например, через биологическую мембрану). Для растущих клеток требуется также учет процессов биосинтеза и биоде­градации макромолекул. В настоящее время еще не созданы математические модели, которые бы исчерпывающе описывали кинетику действия иммобилизованных клеток, — это задача бли­жайшего будущего.

алБильнось

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Во Введении отмечалось, что главное преимущество иммоби­лизованных фор мс нто Q перед свободными (несвязанными) заключается в их большей технологичности. Одним из проявле­ний этого является более высокая стабильность иммобилизован­ных ферментов по сравнению с натнвными. Дело в том, что фер­менты, как класс биологических молекул, обладают очень низкой стабильностью: стандартная свободная энергия нативнои кон-формации при обычных условиях (комнатная температура, физи­ологические значения рН, нормальное давление, определенный состав среды), как правило, лишь на 20—60 кДж/моль меньше свободной энергии денатурированной формы. Это соответствует энергии всего лишь нескольких водородных связей или одного-двух солевых мостиков и намного меньше энергии обычных кова-лентных связей, составляющих сотни кДж/моль. Поэтому даже небольших отклонений внешних условий от тех, которые харак­терны для микроокружения ферментов в клетке, может оказаться достаточно, чтобы нарушить структуру и функцию фермен­тов, т. е. нлактивировать их.

Р Для практических целей, однако, часто требуется, чтобы ферменты работали при повышенных температурах» экстремаль­ных значениях рН, в присутствии высоких концентраций органи­ческих растворителей или поверхностно активных веществ и т. п. В связи с этим возникает проблема существенного увеличения стабильности ферментов.