• Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.
• Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь - из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков
• Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.
• При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин.
• Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.
• С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.
• До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота
Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. Как известно, инсулин широко применяется при лечении инсулино-зависимой формы сахарного диабета.
Молекула инсулина состоит из двух цепей А-цепь – 21 аминокислота и В- цепь – 30 аминокислот. Молекула стабилизирована тремя дисульфидными связями, которые необходимы для ее нормального функционирования. В организме человека и животных синтезируется проинсулин, в котором А и В-цепи соединены С-пептидом. После синтеза С-пептид выщепляется под действием протеолитических ферментов с образованием инсулина.
|
|
До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:
1)недостаток поголовья скота;
2)сложности хранения и транспортировки сырья;
3)трудности выделения и очистки гормона;
4)возможность развития аллергических реакций.
Все это сделало необходимым поиск альтернативных источников получения препарата. До настоящего времени единственным вариантом такого получения является микробиологический синтез с использованием рекомбинантных микроорганизмов.
В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:
1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;
Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.
2) генно-инженерным способом;
Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором (2.2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.
|
|
Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).
Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.
• 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).
• 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).
• 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.
• 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.
• 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.
• 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.
• 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.
Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.
Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.
Синтез методом
• В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина:
• Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина.
• С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.
• Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.
• Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.
• В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.
• Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.
• Из проинсулина выделяется инсулин.