Лабораторна робота № 5

Тема: Методи стерилізації.

Мета: Ознайомитися з принципами й методами стерилізації, засвоїти правила підготовки посуду й інструментів до стерилізації.

Матеріали та устаткування: вата гігроскопічна, марля (бинт), нитки, ножиці, скляні палички, піпетки градуйовані ємністю 1, 2, 5 і 10 мл, колби конічні й круглі плоскодонні (колби Виноградського, колби Ерленмейєра) ємністю 250, 500, 1000 мл, чашки Петрі, металеві пінцети, крафт-папір, олівці для скла, спиртівки (сухе пальне), бактеріологічні петлі, шпателі Дригальського, автоклав, сушильна шафа.

Стерилізація є одним із найважливіших і необхідних прийомів у мікробіологічній практиці. Культивування організмів здійснюється обов'язково в стерильних умовах. Під стерилізацією чи знеплідненням розуміють повне знищення живих мікроорганізмів та їх живильних форм (спор) у живильних середовищах, посуді, сухих матеріалах, на інструментах й інших предметах лабораторного устаткування.

Існують різні методи стерилізації: фізичний, механічний і хімічний.

Фізичні методи стерилізації:

– прожарювання в полум'ї;

– стерилізація сухим жаром (гарячим повітрям у сушильній шафі);

– стерилізація кип'ятінням;

– стерилізація насиченою парою під тиском (автоклавування);

– дробова стерилізація (тиндалізація);

– стерилізація ультрафіолетовим опроміненням.

Хімічний метод стерилізації:

– дезінфекція антисептиками.

Механічний метод стерилізації:

– фільтрування за допомогою мембранних фільтрів і фільтрів Зейтця.

Можливість та доцільність застосування того чи іншого способу визначається особливостями матеріалу, що підлягає стерилізації, його фізичними й хімічними властивостями, метою дослідження.

Найчастіше в мікробіологічній практиці застосовується термічна стерилізація.

Стерилізація випалюванням у полум'ї пальника

Невеликі скляні й металеві предмети (голка, петля, пінцет, скальпель, палички, шпатель) стерилізують прожарюванням у полум'ї безпосередньо перед використанням. Стерилізація досягається обвуглюванням мікроорганізмів, що знаходяться на їхніх поверхнях. Випалюванням у полум'ї користуються для стерилізації поверхні ватяних пробок, горла посуду.

Стерилізація в автоклаві парою під тиском

Найбільш надійний і універсальний метод стерилізації живильних середовищ і матеріалів – стерилізація їхньою насиченою парою під тиском вище атмосферного. Підвищений тиск пари створюється у спеціальних герметично закритих товстостінних апаратах (автоклавах). Предмети, що підлягають стерилізації в автоклаві, загортають у папір. Повна стерилізація живильних середовищ забезпечується нагріванням протягом 20 хвилин за умови 120°С і надлишкового тиску 1 атм.

Стерилізація кип'ятінням

Стерилізацію металевих інструментів і гумових трубок виконують кип'ятінням. Спори деяких бактерій зберігають життєздатність під час кип'ятіння у дистильованій воді протягом декількох годин, тому рекомендується стерилізацію кип'ятінням виконувати у 2%-ному розчині карбонату натрію протягом 10 хв. У цих умовах спори гинуть.

Стерилізація сухим жаром

Сухим жаром стерилізують, в основному, скляний посуд. Щоб уникнути зараження предметів, що простерилізовані, із повітря, їх перед стерилізацією загортають в обгортковий папір і виймають із неї тільки перед роботою.

Стерилізація текучою парою. Дробова стерилізація, або тиндалізація

Живильні середовища (молоко, солод, желатину), воду, гумові трубки й інші предмети, що псуються від дії сухого жару, піддають стерилізації текучою парою. Стерилізації текучою парою роблять у кип'ятильнику Коха чи в автоклаві з відкритим вентилем. Воду в них доводять до кипіння, і пара, що утвориться, обтікає об'єкти. Температура живильних середовищ, що стерилізуються, досягає 100°С. Нагрівання протягом 30-45 хвилин призводить до загибелі вегетативних клітин бактерій, але спори їх не гинуть. Наступного дня нагрівання повторюють. За цих умов гинуть вегетативні клітини, що розвилися зі спор. Для забезпечення повної стерильності рідину залишають ще на добу і знову повторюють нагрівання. Таку стерилізацію називають дрібною, або тиндалізацією.

Пастеризація

В основі пастеризації полягає нагрівання рідин до температури менше 100°С. Мета її – знищення безспорових бактерій у рідинах, що втрачають живильні властивості під час кип'ятіння (молоко, пиво, вино та ін.). Здійснюється пастеризація нагріванням рідин при 60°С упродовж 30 хвилин, чи при 75°С упродовж 15 хвилин, або при 80°С упродовж 10 хв.

Холодна стерилізація

Органічні рідини, що не виносять нагрівання, звільняють від бактерій, пропускаючи через стерильні дрібнопористі фільтри. Ці фільтри затримують мікроорганізми, їх називають бактеріальними фільтрами. Бактеріальні фільтри мають різні номери. Фільтри № 1 мають середній діаметр пір 0,3 мкм, вони найбільш надійні. Перед уживанням мембранні фільтри стерилізують кип'ятінням. Фільтри поміщають у теплу дистильовану воду і кип'ятять 30 хвилин, змінюючи її 2-3 рази.

Предмети, що виготовлені з термолабільних пластмас, наприклад, центрифужні пробірки, стерилізують ультрафіолетовими променями. Час опромінення встановлюють експериментально. Воно залежить від потужності бактерицидної лампи й відстані між лампою й об'єктом.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Ознайомитися з режимами стерилізації живильних середовищ посуду й інструментів (Додаток 2).

Живильні середовища стерилізують, головним чином, автоклавуванням, що виконують за різними режимами. Коли вказують режим стерилізації в одиницях тиску, мають на увазі додатковий тиск.

Температура та тривалість автоклавування визначається насамперед складом живильного середовища. Субстрати, що містять речовини, які не витримують нагрівання до 120°С, стерилізують із тиском 0,5 атм. Молоко, дріжджовий автолізат, середовища із желатиною стерилізують з тиском 0,5 атм. протягом 15 хв. Середовища, що містять цукри і вітаміни, наприклад, пивне сусло, соки, стерилізують із тиском 0,5 атм. 20-30 хв. МПБ і МПА автоклавують із тиском 1 атм. 20-30 хвилин, картопляне середовище і ґрунтову витяжку – тиском 1,5 атм. 30 хв.

2. Виготовити ватно-марлеві пробки для пробірок і колб різної ємності.

Ватно-марлеві пробки оберігають посудини із середовищами від зараження мікрофлорою, що знаходиться в навколишньому повітрі. Кращою ватою для виготовлення пробок є гігроскопічна вата. Правильно виготовлена пробка повинна легко входити в пробірку (колбу) і щільно прилягати до її стінок, не порушуючи газообміну між вмістом посудини і зовнішнім середовищем. Після витягання із посудини форма пробки не повинна змінюватися.

Для виготовлення пробки плоский шматок вати скачують валиком. Щоб додати пробці міцність, її прокочують між долонями або між долонями і чистим склом, що лежить на столі. Довжина пробки для звичайної пробірки повинна бути близько 4 см. Пробка повинна входити в пробірку на 1,5-2 см. Для збереження форми пробку виймають із горлечка, злегка обертаючи. Зручно обгорнути пробку чистою марлевою серветкою.

3. Підготувати до стерилізації мікробіологічні пробірки, піпетки, чашки Петрі, шпателі Дригальського.

Основним способом стерилізації скляного посуду є обробка гарячим повітрям у сушильних шафах. Посуд перед стерилізацією ретельно миють, сушать і загортають у папір для збереження стерильності після прогрівання.

Пробірки, колби попередньо закривають ватно-марлевими пробками. Пробірки поєднують по 15-20 штук і загортають у папір.

Кожну піпетку загортають окремо в довгі смужки паперу шириною 3-4 см. Попередньо в кінець піпетки, що беруть у рот, вкладають ватяний тампон. Обмотування починають із протилежного кінця. Капілярний кінець піпетки кладуть на смужку паперу під кутом 45° і загортають за спіраллю. Загорнені піпетки для запобігання від забруднення й розривів загортають кілька штук разом.

Шпателі обгортають окремо, а потім, як і піпетки, поєднують.

Чашки Петрі загортають у папір у формі квадрата. Чашку Петрі поміщають на середину аркуша, загинають його з двох протилежних сторін догори, край двічі загинають швом. Два вільних кінці загинають униз. Таке обгортання чашок дає можливість легко розрізняти верх і низ. Дві-чотири чашки Петрі загортають разом.

Підготовлений таким способом посуд поміщають у сушильну шафу і прогрівають при температурі 160-170°С упродовж 2 годин. У таких умовах гинуть не тільки бактерії, але і їхні спори. Температуру в сушильній шафі вище 175°С допускати не слід, тому що це призведе до побуріння ватяних пробок, а паперова обгортка стає ламкою.

Простерилізувати прожарюванням у полум'ї Простерилізований посуд зберігають у закритому, захищеному місці. Розгортають її безпосередньо перед використанням.

4. Підготувати до стерилізації бактеріологічні петлі, голки, гачки.

Узяти бактеріологічну петлю у праву руку й у горизонтальному положенні внести її у нижню, найбільш холодну частину полум'я, а потім перенести в положення, близьке до вертикального, і нагріти до червоності у верхній частині полум'я пальника спочатку нижню, потім верхню частину дроту і пропалити петлеутримувач. Прожарювати в цілому 5-7 с.

 

 

Лабораторна робота № 6

 

Тема: Фізіологія мікроорганізмів. Живильні середовища для вирощування мікроорганізмів. Культивування мікроорганізмів. Одержання накопичувальних культур.

Мета: Ознайомитися з потребами мікроорганізмів у живильних речовинах і принципами складання живильних середовищ для їхнього вирощування. Приготувати рідкі й густі (натуральні та синтетичні) живильні середовища, засвоїти правила підготовки живильних середовищ до стерилізації. Засвоїти методи одержання накопичувальних культур різноманітних фізіологічних груп мікроорганізмів із подальшим виділенням чистих культур.

Матеріали й устаткування: несхмелене пивне сусло, пептон, агар-агар, дріжджі, картопля, вівсяні пластівці, молоко, сироватка, желатин та інші компоненти для готування живильних середовищ, колби Виноградського, колби Ерленмейєра, мікробіологічні пробірки з ватно-марлевими пробками, циліндри, ваги технічні, електроплитка, скляні палички, піпетки, крейда, NaCl, вата, марля, фільтрувальний папір, лійки, автоклав. Бульби картоплі, сіно, дріжджі, молоко, пиво, розсіл капусти або огірків, ножиці, конічні колби на 250 мл, мікробіологічні пробірки, крейда, вата, електроплитка, водяна баня, чашки Петрі, фільтрувальний папір.

Мікроорганізми розрізняються з хімічного складу, типу живлення, дихання, способу одержання енергії, розмноження, стійкості до факторів навколишнього середовища. Живлення є найважливішою функцією мікроорганізмів. Як і всім іншим організмам, їм необхідний набір різних хімічних елементів. Для накопичення, виділення, культивування й збереження мікроорганізмів користуються живильними середовищами. До складу цих середовищ включені живильні речовини, що необхідні у здійсненні обміну між бактеріальною клітиною та середовищем. Обмін речовин мікроорганізмів (бактерій) включає два основних процеси – одержання енергії (енергетичний обмін) і біосинтез речовин клітини (конструктивний обмін). Ці два обміни являють собою різні сторони єдиного метаболізму.

Мікроорганізми повинні бути забезпечені джерелом енергії й одержувати ззовні в необхідних кількостях елементи, що входять у їхній склад для здійснення біосинтезу, розмноження і росту. Це – біогенні (С, О, Н, N); зольні елементи (Р, S, K, Mg, Ca, Fe) і мікроелементи, що стимулюють ріст клітинної маси (у малих дозах) – Zn, Mn, B, Cu, Mo, Co та ін.

У мікробіологічній практиці для вирощування мікроорганізмів використовують різноманітні живильні середовища, які за складом поділяють на природні, або натуральні, напівсинтетичні й синтетичні середовища.

Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного й тваринного походження – м'яса, молока, картоплі, моркви, овочевих і фруктових соків, молочнокислої сироватки, відварів, екстрактів, отриманих із природних субстратів.

Прикладами натуральних середовищ можуть слугувати:

– м’ясопептонний бульйон, що складається з екстракту м'яса (500 м м'яса на 1 л води), 0,5% NaCl і 1% пептону (продуктів неповного розкладання білка);

– несхмелене пивне сусло, яке приготовлене на основі солоду (пророслих зерен ячменю) і містить цукри;

– дріжджове середовище, що складається з екстракту дріжджів (7-10 г сухих дріжджів на 1 л води), до якого додають вуглеводи (1-2%), мінеральні солі К₂НРО₄ (0,1%); і NaCl (0,5%);

– картопляне середовище – відвар картоплі (200 г картоплі на 1 л води);

– витяжки з ґрунту та ін.

На натуральних середовищах добре розвиваються багато мікроорганізмів, тому що в таких середовищах маються, як правило, усі компоненти, необхідні для їхнього росту.

Для вирощування мікроорганізмів, що використовують органічні форми азоту, найчастіше вживають м’ясопептонні середовища: м’ясопептонний бульйон (МПБ), м’ясопептонний агар (МПА) і м’ясопептонну желатину (МПЖ).

Солодове (несхмелене пивне) сусло – гарне середовище для деяких молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів і інших представників гетеротрофних організмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи й азотовмісні речовини.

Несхмелене пивне сусло, що отримують із пивоварного заводу, розбавляють водою до 6-7° за Баллінгом і використовують для культивування багатьох мікроорганізмів. Якщо готове сусло відсутнє, користуються солодовим середовищем, що готують у такий спосіб. Зернівки ячменю пророщують до накльовування, потім висушують їх при температурі 60-70°С і мелють на кавовому млині. Нагрівають 1 л води до 50°С і, перемішуючи, всипають у неї 250 г меленого солоду. Залишають у воді без нагрівання на 30 хвилин, потім воду нагрівають і підтримують температуру 55-58°С. Час від часу з рідини беруть проби на крохмаль (йодна проба). Коли йодна проба покаже повне оцукрювання крохмалю, сусло фільтрують і потім стерилізують тиском ½ атм. протягом 30 хвилин (так само стерилізують готове сусло). Варто мати на увазі, що для культивування дріжджів використовують сусло, яке містить 6-8% цукру, а для молочнокислих бактерій – 8-12%, тому у суслі потрібно визначити вміст цукру. Сусло стерилізують температурою 115°С і тиском 0,5 атм. упродовж 30 хв.

Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Для його готування скляну лійку покрити марлевою серветкою такої величини, щоб кінці серветки були перекинуті через край лійки назовні, потім на марлю покласти шар гігроскопічної вати і змочити фільтр гарячою дистильованою водою. Агаризоване середовище налити на фільтр у гарячому вигляді. Процес фільтрації виконувати в нагрітій водяній бані.

Після фільтрації живильні середовища розливають у посудини (колби Ерленмейєра ємністю 250 мл). Наливати треба не вище 2/3 висоти посудини. Посуд заздалегідь ретельно миють, висушують, закривають ватно-марлевими пробками, що убезпечує середовище від зараження мікроорганізмами, які знаходяться в навколишньому повітрі. Тому пробки повинні бути досить щільними, з рівномірним розподілом волокон вати. Не можна обертати пробки посудин, що будуть стерилізуватися в автоклаві, целофаном чи іншими матеріалами, що не пропускають пару. Пара повинна обов'язково проникати через пробку в посудину, інакше середовища не нагріються до потрібної температури і не простерилізуються. Посуд необхідно заздалегідь простерилізувати, якщо налиті в нього середовища стерилізують текучою парою чи тиском не більше 0,5 атм. Якщо ж живильні середовища стерилізують під тиском вище 1 атм., то попередня стерилізація посуду необов'язкова.

Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. Якщо передбачається вирощування мікроорганізмів на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більше, ніж на 1/3. Для розливання живильних середовищ користуються лійкою. Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і будуть важко вийматися, ускладнюючи процес роботи.

Зверху ватно-марлевої пробки на колби й флакони варто надіти паперові ковпачки й підписати назву живильного середовища та дату її готування.

Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з розплавленим на киплячій водяній бані середовищем установлюють у похилому положенні і дають середовищу застигти. Скошене гаризоване середовище не повинне доходити до ватяної пробки на 4-6 см. Середовище, що призначене для культивування бактерій у чашках Петрі, розливають по 15-20 мл у пробірки більшого об’єму, ніж для скошеного агаризованого середовища, чи стерилізують у колбах. В останньому випадку до стерилізації агар не розплавляють.

Іноді для культивування мікроорганізмів використовують напівсинтетичні середовища:

МПБ із 2%-ним розчином глюкози; дріжджовий автолізат із солями амонію й вуглеводами у певному співвідношенні. Ці середовища широко використовують для одержання вітамінів, антибіотиків, амінокислот й інших продуктів.

Синтетичні середовища, що включають тільки відомі хімічно чисті речовини, у точно зазначених концентраціях: середовище Виноградського для нітрофіксуючих бактерій, глюкозомінеральне середовище для Achromobacter.

Синтетичні середовища бувають простими за складом чи мають великий набір щодо компонентів. Їх широко використовують для вивчення обміну речовин мікроорганізмів.

За призначенням розрізняють елективні й диференційно-діагностичні середовища.

Елективні (виборчі) середовища забезпечують переважний розвиток одного виду чи групи родинних мікроорганізмів: середовище Чапека (для актиноміцетів), середовище Врублевського, Кітта-Тароцци (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілококів, стійких до новобіоцину). Диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, що досить добре дозволяють відрізнити одні види мікроорганізмів від інших: середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

З фізичного стану (консистенції) живильні середовища розділяються на: рідкі (МПБ), густі (МПА), сипучі (розварене пшоно, висівки, що просочені живильним розчином).

Для з'ясування фізико-біологічних особливостей мікроорганізмів, а також для накопичення їхньої біомаси чи продуктів обміну найзручніше застосовувати рідкі середовища.

Напіврідкі середовища готують, додаючи 0,1-0,2% агар-агару. Агар-агар – рослинний колоїд, що одержують із деяких морських водоростей (складається в основному з полісахаридів, включає азотисті речовини).

Сипучі середовища іноді застосовують у промисловій мікробіології. До них належать, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочені живильними розчинами.

Густі (тверді) середовища використовують для виділення чистих культур (одержання ізольованих колоній), у діагностичних цілях: опис колоній, встановлення характеру росту на скошеному МПА та ін., для збереження культур, для кількісного обліку мікроорганізмів, визначення їхніх антагоністичних властивостей. Густі середовища готують із рідких, додаючи для згущення агар-агар (1,5-2,5%), желатину (10-15%) чи кремнекислий гель, Найчастіше в мікробіологічній практиці для згущення середовищ використовується агар-агар. Це складний полісахарид, більшість мікроорганізмів не використовують його як живильний субстрат. У воді агар-агар утворює гелі, які плавляться при температурі 100°С, що твердіє при температурі близько 40°С. Желатина – білок, що одержують у процесі виварювання кісток і хрящів тварин. Желатину до рідких середовищ додають у кількості 10–15% (желатиновий гель плавиться при 23-26°С).

 

Культивування мікроорганізмів

Вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах називається культивуванням, а розвинені мікроорганізми, отримані від тварини, людини, чи рослини, субстрату зовнішнього середовища, – культурою. Розвиток культури м/о в рідкому середовищі призводить до утворення суспензії або осаду, плівки, на твердому середовищі – колонії. Культивування за умов певної температури (у термостаті) називається інкубацією.

У мікробіологічній практиці широко використовуються як чисті культури мікроорганізмів, так і консорціуми.

Для вивчення фізіолого-біологічних особливостей розвитку бактерій, а також для встановлення їхньої видової приналежності необхідно виділяти чисті культури, що складаються з мікроорганізмів одного виду.

Консорціуми – змішані чи асоціативні культури, що складаються з 2-х і більше мікроорганізмів, між якими існують різні форми взаємин.

Чиста культура мікроорганізмів одного виду, що виділена з певного джерела і відрізняється від інших представників виду незначними змінами, називається штамом. Чиста культура мікроорганізмів, що є потомством однієї єдиної клітини, називається клоном.

Виділення чистої культури здійснюють поетапно:

– одержання накопичувальної культури;

– виділення чистої культури з ізольованих колоній за методом Коха;

– визначення чистоти культури, що виділена, та вивчення культуральних властивостей;

– ідентифікація мікроорганізмів із різних властивостей: морфологічних, тинкторіальних, біохімічних (ферментативних), антигенних і т. п.

Накопичувальними культурами називаютьсякультури, які складаються переважно з клітин одного виду.

Для одержання мікроорганізмів визначених фізіологічних груп Виноградським запропонована техніка «накопичувальних культур», заснована на використанні елективних (виборчих) середовищ, що забезпечують переважний розвиток визначених бактерій. Інші організми в цих умовах не можуть розмножуватися чи їхній ріст буде дуже незначний.

Внесення клітин мікроорганізмів (зразка ґрунту, проби води) у стерильне живильне середовище для одержання накопичувальної чи чистої культури називається посівом, чи інокуляцією. Для одержання накопичувальних культур кращим матеріалом для інокуляції слугують субстрати, в яких відбувається їх природне «збагачення».

Елективні умови передбачають ряд факторів, наприклад, потреба м/о у живильному субстраті, відношення до кисню, кислотності середовища, температури, здатність до спороутворення і т. д.

Підбираючи оптимальний склад живильного середовища та параметри культивування й інокулюючи середовище якими-небудь природними субстратами, що містять різноманітні м/о, можна одержати накопичувальну культуру організмів, що характеризуються певними фізіолого-біохімічними властивостями. З накопичувальних культур виділяють чисту культуру м/о.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Ознайомитися з рецептурами різних натуральних і синтетичних живильних середовищ (Додаток 3).

2. Приготувати густе живильне середовище на основі сусла.

Сусло-агар (СА) є прекрасним середовищем для молочнокислих бактерій і дріжджів. Для одержання твердого сусло-агару до пивного сусла додають 2% агару. Середовище стає однорідним безпосередньо в процесі стерилізації в автоклаві. Якщо необхідно приготовлене середовище відразу розлити у пробірки, його попередньо перед стерилізацією розплавляють на водяній бані.

3. Приготувати тверде живильне середовище на основі пептонної води (додати агар-агар із розрахунку 2%).

4. Приготувати м’ясо-пептонний агар (МПА).

5. Приготувати середовища для актиноміцетів.

Натуральне середовище – вівсяний агар (г): Вівсяне борошно (чи пластівці) – 20; агар – 20-25; дистильована вода – 1000 мл; сліди солей FeSO₄ – 0,1; MnCl₂ – 0,1; ZnSO₄ – 0,1. Замість дистильованої води і солей можна використовувати водопровідну воду. Для готування середовища вівсяне борошно (чи пластівці) варять у 1 л води 20 хвилин, фільтрують і доводять об’єм до 1 л. Середовище застосовують для збереження й визначення культуральних, а також морфологічних ознак.

Синтетичне середовище – середовище Гаузе (г): крохмаль розчинний – 20; КNO₃-1,0; К₂НРО₄ – 0,5; MgSO₄·7H₂O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO₄ – сліди; рН 7,0-7,4; дистильована вода – 1000 мл.

6. Підготувати середовища до стерилізації.

7. Підготувати для стерилізації 4-5 пробірок із водогінною водою (9 мл) і колбу із 90 мл водогінної води.

8. Середовища й воду віддати на стерилізацію.

9. Одержати накопичувальні культури аеробних спороутворюючих бактерій.

а) Одержати культуру сінної палички (Bacillus subtilis).

Для одержання накопичувальної культури сінної палички помістити приблизно 1 –3 г сіна в колбу на 250 мл і залити 20–50 мл водопровідної води, що нагріта до 40-50°С. Добавити пучку крейди і прокип’ятити впродовж 15-30 хвилин, поки середовище не набуде колір настою міцного чаю – із сіна екстрагуються речовини, які будуть живильним матеріалом для бактерій. Вегетативні клітини й спори більшості бактерій за цей час загинуть. Тільки спори деяких бактерій, у тому числі термостійкі спори Bacillus subtilis, залишаться життєздатними. Відвар розлити в стерильні пробірки, закрити їх ватними пробками та розмістити в термостат із температурою 25-30°С.

Через дві доби на поверхні середовища розвивається білувата плівка Bacillus subtilis, яка через 3-4 доби стає сірувато-зеленою. Інші мікроорганізми в цих умовах проростають рідко та в невеликій кількості.

б) Одержати культуру картопляної палички (Bacillus subtilis var. mesentericus).

Промиті бульби картоплі, не очищаючи, нарізати кільцями. Поверхню їх натерти крейдою для нейтралізації середовища й помістити в чашки Петрі на подвійний шар фільтрувального паперу, змоченого дистильованою водою. Чашки с картопляним середовищем обробити текучою парою вподовж 10 хвилин і поставити в термостат із температурою 27-30°С на 3-4 доби.

На поверхні шматочків картоплі з’являється щільна зморшкувата плівка культури картопляної палички. Забарвлення плівки може бути різним: білувато-сірим, рожевим, жовто-бурим, чорним, що залежить від різновидності культури, яка здебільшого розвивається.

10. Одержати накопичувальну культуру анаеробних спороносних бактерій.

Неочищену картоплю нарізають шматочками, які можуть легко увійти в пробірку, заповнюють стерильну пробірку на 1/3 об’єму, додають пучку крейди і заповнюють водою майже доверху. Пробірки ставлять на водяну баню з температурою 80°С на 10-15 хв. Потім пробірки закривають пробками і переносять у термостат із температурою 25°С. У цих умовах уже через 2-3 дні в рідині виявляють елективну культуру бактерій маслянокислого бродіння – Clostridium pasteurianum. Для переважного розвитку саме їх створюються анаеробні умови, безспорові форми знищуються попереднім нагріванням, добавка крейди нейтралізує кислоти, що утворюються, та сприяє розвитку бактерій.

11. Одержати накопичувальну культуруоцтовокислих бактерій (Acetobacter aceti) – аеробних безспорових бактерій.

У стерильну конічну колбу наливають тонкий шар пива (0,5-1,0 см). Товщина шару пива має значення для результату досліду, тому що для оцтовокислих бактерій треба створити аеробні умови. Колби закривають ватяними пробками і ставлять у термостат із температурою 30°С на 5-7 діб.

12. Одержати накопичувальні культури молочнокислих бактерій.

Молочнокислі бактерії з морфологічних властивостей поділяються на молочнокислі палички і молочнокислі стрептококи.

а) Для одержання накопичувальної культури молочнокислих паличок (Lactobacterium plantarum) у стерильні пробірки із солодовим суслом (6-8° за Баллінгом) добавити 12-15% (об’ємних) етанолу 96%-ного і внести 1% розсолу капусти або огірків. Засіяні пробірки помістити в термостат із температурою 30°С.

б) Для виділення молочнокислих стрептококів (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris) свіже молоко наливають у стерильні пробірки і залишають при температурі 30°С для розвитку бактерій. Для подальшого дослідження відбирають пробірки з молоком, в яких утворився згусток раніше, ніж в інших пробірках.

На наступному занятті переконатися в одержанні накопичувальних культур різноманітних мікроорганізмів.

Про одержання накопичувальної культури судять візуально із проявлення ознак росту мікроорганізмів: помутніння середовища, появлення плівки, осаду, пігменту, відділення газів, а також із мікроскопії прижиттєвих і фіксованих мікробіологічних препаратів.

На наступному занятті одержані результати оформити у вигляді таблиці 8.1.

 

Таблиця 8.1 – Характеристика накопичувальних культур

 

Накопичувальна культура	Умови культивуван-ня	Візуальні ознаки росту	Морфологічні особливості

 

Лабораторна робота № 7

Тема: Культивування мікроорганізмів. Техніка посіву. Виділення чистих культур.

Мета: Засвоїти способи вирощування мікроорганізмів на цих живильних середовищах. Засвоїти методи виділення чистих культур, техніку посіву культур бактерій на рідкі і тверді живильні середовища. Засвоїти техніку розливання живильних середовищ.

Матеріали та устаткування: накопичувальні культури (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Streptococcus lactis, Clostridium butiricum, й ін.), зразки ґрунту, чисті культури (Micrococcus lisodeikticus., Streptomyces recifensis), стерильні живильні середовища (МПА, пептонний агар, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе, картопляний агар та ін.), водяна баня, електроплитка, стерильні чашки Петрі, мікробіологічні пробірки, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички, бактеріологічні петлі, спирт етиловий, спиртівка.

Перенесення вирощеної культури м/о клітин з одного середовища у свіже стерильне живильне середовищеназивається пересіванням чи пасеруванням. Пасерування – традиційний метод збереження мікроорганізмів із дотриманням інтервалів, що залежать від того, як одержана накопичувальна культура, приступають до виділення чистої. Чиста культура може бути одержана з окремої колонії або з одної клітини. Основним методом виділення чистих культур є метод Коха. Принцип його полягає в одержанні чистої культури з ізольованої колонії, що розвилася з однієї клітини.

Виділення чистої культури виконують з отриманої накопичувальної культури. Чиста культура може бути одержана механічним роз'єднанням мікроорганізмів методами, що використовують їхні біологічні особливості.

Метод заснований на тому, що за умов нанесення м/о з посівного матеріалу на густе середовище окремі клітини будуть закріплюватися (імобілізуватися) у певній точці твердого середовища і, розмножуючись, давати потомство (клон), що представляє колонію чистої культури м/о.

Спочатку вирощують культуру з механічним відокремлюванням клітин м/о за посівом на густі живильні середовища в чашки Петрі. Таким чином одержують ізольовані колонії, припускаючи, що вони виросли з однієї клітини, і паралельно вивчають культуральні властивості.

Потім виконують виділення чистої культури з ізольованих колоній на скошений агар. Після цього ідентифікують мікроорганізми з різноманітних властивостей.

Внесення клітин мікроорганізмів у стерильне живильне середовище для одержання накопичувальної чи чистої культури називається посівом, чи інокуляцією.

Посів (і пересів) м/о проводять із дотриманням визначених правил стерильності – усі маніпуляції здійснюють біля полум'я пальника (у радіусі 15-20 см) за можливістю швидко, щоб не забруднювати культуру сторонніми м/о. Не рекомендується робити різкі рухи, ходити біля того, хто виконує посів м/о, тому що рух повітря збільшує ймовірність випадкового забруднення культури.

Спосіб посіву в середовище залежить від його консистенції, якості матеріалу, що засівається, і мети дослідження.

Перед посівом необхідно написати на пробірці, колбі чи чашці Петрі назву м/о і дату посіву.