Мутация с азотистой кислотой

Перед тем как приступить к работе магистрантов подразделяют на варианты. В таблице 3 представлены комментарии к вариантам работ.

Таблица 3 – Варианты работ и комментарии

Вариант	Улучшение свойств микроорганизма	Градиентная среда для селеции на основе среды Ридера+ 1,5 агара
	Устойчивость к хлориду натрия	Верхний слой –8 % хлорида натрия (в/в) + 1% глюкозы + 0,5% ДЭ Нижний слой – 12 % хлорида натрия (в/в) + 1% глюкозы + 0,5% ДЭ
2*	Устойчивость к фенолу	Верхний слой –900 г/л фенола (о/в) + 1% глюкозы + 0,05% ДЭ Нижний слой – 1300 г/л фенола (о/в) + 1% глюкозы + 0,05% ДЭ
3*	Устойчивость к фенолу	Верхний слой – 700 % (о/в) + 5% глюкозы Нижний слой – 1200 % (о/в) + 5% глюкозы

* компонент вносить в среду после стерилизации

Для выполнения лабораторной работы готовят среду Ридера согласно по вариантам, которые представлены в таблице 3. Готовые среды разливают в конические колбы на 100 мл по 60 мл. Состав среды представлен в приложении А. Первый вариант сразу в среду отвешивает необходимое количество хлорида натрия.

Параллельно готовятся ацетатные и фосфатные буферные растворы с pH = 4,4 и pH = 7,0 соответственно. Также готовится 0,5 М раствор NaNO₂ и отправляют вместе с буферными растворами на стерилизацию.

Также заранее необходимо простерилизовать в сушильном шкафу чашки Петри (9 шт.), пипетки (9 шт. на 1-2 мл), шпатели (9 шт.).

После автоклавирования сред, варианты 1 и 2 вносят в среду фенол в необходимом количестве. Далее создают градиентный агар, т.е. в стерильную чашку Петри заливают 20 мл среды нижнего слоя и оставляют под наклоном на 20 минут. После того как среда застыла, заливают верхний слой и ждут застывания. Затем производят непосредственно саму мутацию культуры.

Берут косяк микроорганизмов и суспендируют в ацетатном буфере (стерильно). Далее суспензию стерильно переносят в 2 пробирки (по 2,9 мл в каждую). В 1-ую и 2-ую пробирки вносят 0,1 мл свежеприготовленного 0,5 М NaNO₂ и засекают время. Через 20 минут из первой пробирки отбирают суспензию 0,1 мл и переносят в другую пробирку с 0,9 мл фосфатным буфером. Данную операцию проводят после 40 минут со второй пробиркой.

Затем делают высев из каждыхобработанных суспензий на селективные среды (по 2-3 капли суспензии наносят на поверхность среды и тщательно размазывают шпателем). Помимо обработанных суспензий делают рассев исходной суспензии (контроль).

Засеянные чашки Петри помещают в термостат при 30 °С, через 2-3 сутки смотрят выросшие колонии и делают фотографии чашек Петри.

Таблица 4 – Матрица высевов

Варианты	Контроль	20 минут	40 минут
1. Хлорид натрия	Рост отсутствует	Рост отсутствует	Рост отсутствует
2. Фенол*	Сплошной рост культуры	Уменьшение роста культуры с увеличением градиента концентраций	Уменьшение роста культуры с увеличением градиента концентраций
3. Фенол**	Рост отсутствует	Рост отсутствует	Рост отсутствует

 

Результаты.

В части 1 лабораторной работы – мутация с ультрафиолетовым излучением, были получены следующие мутанты культуры дрожжей Н-2:

- мутанты устойчивые к фенолу с концентрацией до 1,2 г/л (рисунок 1,2).

Рисунок 1 - Мутантный штамм дрожжей Н-2, устойчивый к концентрации фенола до 1,2 г/л, полученный при 20 сек. экспозиции под УФ-лучами

Рисунок 2 - Мутантный штамм дрожжей Н-2,устойчивый к концентрации фенола до 1,2 г/л, полученный при 40 сек. экспозиции под УФ-лучами

В части 2 лабораторной работы – мутация с обработкой микроорганизмов азотистой кислотой, были получены следующие мутанты культуры дрожжей Н-2:

- мутанты устойчивые к фенолу с концентрацией до 1,2 г/л.

Рисунок 4 -Мутантный штамм дрожжей Н-2,устойчивый к концентрации фенола от 0,9 до 1,2 г/л, полученный при 40 мин. мутации азотистой кислотой

Вывод: В ходе лабораторных работ методом направленного мутагенеза получали мутантную культуру Н1, устойчивую к NaCl, фенолу и изопропанолу. В качестве мутагенных факторов (мутагенов) были использованы химические (азотистая кислота) и физические воздействия (облучение УФ). В результате проведенных мутаций мы наблюдали, что облученная культура в течение 20 секунд, 40 секунд выросла только на среде с фенолом, использующимся в качестве селективного фактора. В этом случае наблюдались отдельные колонии. Далее из крупных колоний производят выявление (скрининг) и отбор тех, которые удовлетворяют цели мутагенеза. В дальнейшем скрининге при обработке культуры азотистой кислотой наблюдался рост только в случае концентраций фенола от 0,9 до 1,2 г/л, рост наблюдался для культуры обработанной азотистой кислотой как в течение 20 минут, так и в течение 40 минут.

 

ПРИЛОЖЕНИЕ А

(справочное)

 

Состав среды Ридера в г/л

Глюкоза – 10;

Агар микробиологический – 15;

NaCl – 0,5;

MgSO₄ – 0,4;

(NH₄)₂SO₄ – 3;

KH₂PO₄ – 1;

K₂HPO₄ – 0,1;

Дрожжевой экстракт – 5.