Радикалы аминокислот исключительно разнообразны. Это дает возможность использовать для обнаружения большинства аминокислот цветные реакции. Многие из них весьма чувствительны и высокоспецифичны, что позволяет открывать ничтожные количества той или иной индивидуальной аминокислоты в составе сложных смесей, биологических жидкостях, гидролизатах белков и т.п.
Некоторые цветные реакции находят применение для количественного определения аминокислот.
1) Ксантопротеиновая реакция на ароматические амнокислоты. В три пробирки вносят 3 мл раствора пищевого белка (далее везде яичный, желатина (белок коллаген), пшеничный белок) и 1 мл концентрированной азотной кислоты. Смеси осторожно нагревают до появления желтой окраски у яичного белка (время нагревания остальных реакционных смесей должно быть таким же как и для яичного белка). После охлаждения в каждую пробирку добавляют одинаковый объем 10%-ного раствора гидроксида натрия или водного раствора аммиака до появления оранжевой окраски в пробирке с яичным белком.
|
|
В ароматических аминокислотах, содержащих бензольные кольца (тирозин, триптофан, фенилаланин), под действием азотной кислоты происходит реакция нитрования бензольного кольца с образованием окрашенного в желтый цвет нитросоединения. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы.
2) Реакция Миллона на тирозин. В три пробирки к 1 мл соответствующего пищевого белка прибавляют 5 мл 2,5%-ного раствора серной кислоты и перемешивают до полного растворения. Приливают 1 мл реактива Миллона, встряхивают и оставляют стоять при комнатной температуре. Через некоторое время раствор окрашивается в кроваво-красный цвет. Для ускорения появления окраски раствор можно слегка подогреть.
Реактив Миллона представляет собой смесь нитратов и нитритов оксида ртути (І) и (ІІ), растворенных в концентрированной азотной кислоте. При взаимодействии его с фенольным ядром тирозина возникает нитрозотирозин, ртутное соединение которого окрашено в красный цвет при достаточном количестве этой аминокислоты в пищевом белке.
3) Реакция Сакагучи на аргинин. В три пробирки наливают 2 мл пищевого белка, прибавляют 2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α- нафтола. Хорошо перемешивают содержимое пробирки, приливают 0,5 мл раствора гипобромита натрия и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-ного раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания при наличии в белке достаточного количества аргинина.
|
|
4) Реакция Паули на гистидин и тирозин. К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты прибавляют 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно приливают сначала 2 мл пищевого белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. При наличии достаточного количества гистидина в белке развивается интенсивная вишнево-красная окраска.
При взаимодействии кислого раствора сульфаниловой кислоты с нитритом натрия осуществляется реакция диазотирования и образуется диазобензолсульфоновая кислота. При реакции последней с гистидином образуется азосоединение вишнево-красного цвета.
5) Реакции на триптофан. Реакция Адамкевича. К 0,5 мл пищевого белка добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое количество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают, а затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Через 10 минут на границе раздела двух слоев наблюдается образование красно-фиолетового кольца при достаточном количестве триптофана в белке. Реакцию можно ускорить, поместив пробирку с реагирующей смесью в кипящую водяную баню.
Триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации.
6) Реакции на триптофан. Реакция Вуазене. К 2 мл пищевого белка добавляют одну каплю 2,5%-ного раствора формальдегида, смесь перемешивают и вливают порциями по несколько капель 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Смесь опять перемешивают и дают отстояться 10 минут. В дальнейшем при перемешивании в пробирку вносят 10 капель 0,5%-ного раствора нитрита натрия. Возникает интенсивная сине-фиолетовая окраска при достаточном количестве триптофана в белке.
7) Реакция Фоля на «слабосвязанную» серу цистеина и цистина. В пробирку вносят 1 мл пищевого белка, 2 мл концентрированного раствора гидроксида натрия и 0,5 мл 10%-ного раствора ацетата свинца. Смесь тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане 2 минуты. Через 3-5 минут выпадает бурый или черный осадок сульфида свинца при наличии в белке достаточного количества цистеина и цистина.
При кипячении цистеина и цистина в щелочной среде от них легко отщепляется сера в виде сульфид-иона. Для выявления сульфид-иона можно использовать ацетат свинца, который при взаимодействии с гидроксидом натрия образует плюмбит натрия. В свою очередь плюмбит натрия, реагируя с сульфид-ионом (из сульфида натрия), приводит к образованию сульфида свинца черного цвета.
Таблица
Белок | Наблюдения | Интен-сивность окраски |
1) Ксантопротеиновая реакция на ароматические амнокислоты | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы | ||
2) Реакция Миллона на тирозин | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы | ||
3) Реакция Сакагучи на аргинин | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы | ||
4) Реакция Паули на гистидин и тирозин | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы | ||
5) Реакции на триптофан. Реакция Адамкевича | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы | ||
6) Реакции на триптофан. Реакция Вуазене | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы | ||
7) Реакция Фоля на «слабосвязанную» серу цистеина и цистина | ||
Яичный белок | ||
Желатина | ||
Белок пшеницы |
- не окрашено
+ слабая окраска
++ окраска средней интенсивности
+++ интенсивная окраска
|
|
Выводы:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Тесты для самопроверки и контроля знаний:
1. В каких пищевых продуктах белки связаны с водой?
а) мясе, рыбе;
б) крупах;
в) муке;
г) мясе, рыбе, крупах, муке.
2. В каких продуктах питания белки в воде набухают с образованием клейковины?
а) мясе;
б) муке;
в) крупах, бобовых;
г) муке, крупах, бобовых.
3. Последствиями денатурации белка являются:
а) потеря нативных свойств;
б) уменьшение способности связывать воду и стойкости из-за разрушения гидратной оболочки;
в) увеличение доступности для пищеварительных протеолитических ферментов, потеря растворимости и коагуляции;
г) все вышеперечисленное.
4. Какие факторы вызывают денатурацию белка?
а) тепловые, лучевые;
б) механические;
в) химические;
г) тепловые; лучевые; механические; химические.
5. Какой белок соединительной ткани является наиболее распространенным?
а) коллаген;
б) актин;
в) миозин;
г) эластин.
6. Какие основные изменения происходят с белками муки в процессе приготовления теста и его выпекания?
а) набухание;
б) денатурация;
в) набухание и денатурация;
г) переход коллагена в глютин.