Обычно ферменты выделяют из различных объектов животного, растительного или микробного происхождения и изучают их действие вне клетки и организма. Эти исследования очень важны для понимания механизма действия ферментов, изучения их состава, особенностей катализируемых ими реакций. Но полученные таким образом сведения нельзя механически непосредственно переносить на деятельность ферментов в живой клетке. Вне клетки трудно воспроизвести те условия, в которых работает фермент, например в митохондрии или лизосоме. К тому же не всегда известно, сколько из имеющихся молекул фермента участвует в реакции — все или только какая-то их часть.
Почти всегда оказывается, что клетка содержит тот или иной фермент, по содержанию превышающий в несколько десятков раз необходимое количество для осуществления нормального обмена веществ. Обмен веществ различен по интенсивности в разные периоды жизни клетки, однако ферментов в ней значительно больше, чем того требовал бы самый максимальный уровень обмена веществ. Например, в состав клеток сердечной мышцы входит столько цитохрома с, которое могло бы осуществить окисление, в 20 раз большее, чем максимальное потребление кислорода сердечной мышцей. Позднее были обнаружены вещества, которые могут «выключать» часть молекул ферментов. Это так называемые тормозящие факторы. Для понимания механизма действия ферментов важно и то, что в клетке они находятся не просто в растворе, а встроены в структуру клетки. Сейчас уже известно, какие ферменты вмонтированы в наружную мембрану митохондрии, какие встроены во внутреннюю, какие связаны с ядром, лизосомами и другими субклеточными структурами.
|
|
Близкое «территориальное» расположение фермента, катализирующего первую реакцию, к ферментам, катализирующим вторую, третью и последующие реакции, сильно влияет на суммарный результат их действия. Например, в митохондрии вмонтирована цепь ферментов, передающих электроны на кислород,— цитохромная система. Она катализирует окисление субстратов с образованием энергии, которая аккумулируется в АТФ.
При извлечении ферментов из клетки слаженность их совместной работы нарушается. Поэтому изучать работу ферментов стараются без разрушения тех структур, в которые встроены их молекулы. Например, если срез ткани подержать в растворе субстрата, а затем обработать реактивом, который с продуктами реакции даст окрашенный комплекс, то в микроскопе будут четко видны окрашенные участки клетки: в этих участках был локализован (расположен) фермент, который расщеплял субстрат. Так было установлено, в каких именно клетках желудка содержится пепсиноген, из которого получается фермент пепсин.
|
|
Сейчас широко распространен другой метод, который позволяет установить локализацию ферментов,— разделительное центрифугирование. Для этого исследуемую ткань (например, кусочки печени лабораторных животных) измельчают, а затем готовят из нее кашицу в растворе сахарозы. Смесь переносят в пробирки и вращают их с большими скоростями в центрифугах. Различные клеточные элементы в зависимости от их массы и размеров распределяются в плотном растворе сахарозы при вращении примерно следующим образом:
Для получения тяжелых ядер требуется относительно небольшое ускорение (меньшее число оборотов). После отделения ядер, увеличив число оборотов, последовательно осаждают митохондрии, микросомы, получают цитоплазму. Теперь активность ферментов можно изучать в каждой из выделенных фракций. Оказывается, что большинство из известных ферментов локализованы преимущественно в той или иной фракции. Например, фермент альдолаза локализован в цитоплазме, а фермент, окисляющий капроновую кислоту,— преимущественно в митохондриях.
При повреждении мембраны, в которую встроены ферменты, комплексные взаимосвязанные процессы не протекают, т. е. каждый фермент может действовать только сам по себе.
Клетки растений и микроорганизмов, как и клетки животных, содержат очень похожие клеточные фракции. Например, пластиды растений по ферментному набору напоминают митохондрии. В микроорганизмах обнаружены зерна, напоминающие рибосомы и тоже содержащие большие количества рибонуклеиновой кислоты. Ферменты, входящие в состав животных, растительных и микробных клеток, обладают сходным действием. Например, гиалуронидаза облегчает микробам проникновение в организм, способствуя разрушению клеточной стенки. Этот же фермент обнаружен в различных тканях животных организмов.