Качественные пробы на присутствие ферментов

           Опыт 5. Открытие пероксидазы в хрене

            Бензидиновая проба. К 10 каплям водного экстракта хрена добавляют 5 капель спиртового раствора бензидина и затем 2 капли 0,5% раствора перекиси водорода. Возникает темно-синее окрашивание вследствие окисления бензидина в n, n’-дииминодифенилхинон.

 

 

           Опыт 6. Открытие пероксидазы в картофеле

           Небольшое количество протертого картофеля переносят в пробирку, добавляют 10-20 капель 1%-ного раствора пирогаллола и 1-2 капли 2%-ного раствора перекиси водорода. При стоянии выпадает желто-бурый осадок пурпурогаллина

           Многократное дегидрирование (окисление) пирогаллола осуществляется с участием пероксидазы, содержащейся в картофеле.

 

           Опыт 7. Открытие тирозиназы в картофеле

           Тирозиназа относится к группе ферментов, действующих на фенолы и родственные им соединения (групповая специфичность). Акцептором электронов служит молекулярный кислород.

           Ход выполнения опыта. В пробирку наливают 1 мл экстракта картофеля, 2-3 капли тиразина, перемешивают и помещают пробирку в водяную баню, нагретую до 40°С. Время от времени пробирку встряхивают для лучшего соприкосновения жидкости с воздухом. Окраска смеси становится розово-красной, затем - бурой и через 1-2 ч – черной, т.к. под действием тирозиназы тирозин превращается через окрашенные в красный цвет промежуточные продукты в черный пигмент меланин.

Аналогичную работу можно проделать, взяв вместо тирозина 0,1%-ного раствор адреналина.

 

               

Контрольные вопросы к отчету по теме: «Свойства ферментов»

 

1. Какие вещества называются ферментами? Какова их химическая природа?

2. Строение ферментов, активный центр, аллостерический центр.

3. Что такое специфичность действия ферментов? Назовите виды специфичности.

4. Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции.

5. Влияние температуры и рН среды на активность действия ферментов.

6. Активирование ферментативных реакций.

7. Ингибирование ферментов: а) обратимое (конкурентное и неконкурентное); б) необратимое ингибирование; в) типы ингибиторов.

8. Классификация и номенклатура ферментов.

9. Механизм действия ферментов.

10. Механизм действия НАД, НАДФ.

11. Механизм действия ФАД.

12. Окислительное фосфорилирование АДФ, его связь с тканевым дыханием.

13. Регуляция ферментативной активности.

 

 

 

 

Занятие 5. Углеводы

 

Значение углеводов для растительных и животных организмов исключительно велико. В животных организмах они выполняют энергетическую функцию и входят в состав многих важных биологически активных структур. В растительных организмах углеводы являются основным энергетическим и главным опорным материалом для клеток и тканей.

Все углеводы по своему строению ^_ это многоатомные спирты, содержащие альдегидную или кетонную группы. При изучении углеводов следует обратить внимание на классификацию, по которой углеводы делятся на три группы в зависимости от числа структурных единиц, входящих в молекулы: моносахариды, олигосахариды и полисахариды. Далее нужно уяснить строение важнейших представителей отдельных групп углеводов и уметь объяснить образование циклических форм моносахаридов, в которых вместо карбонильной группы возникает гликозидный (полуацетальный) гидроксил. В свойствах моносахаридов следует знать оптическую изомерию, окислительно-восстановительные свойства, образование гидразонов и озазонов. В дисахаридах важно понимать, как моносахариды связаны между собой и каким образом расположена гликозиднаясвязь.

Следует обратить особое внимание на полисахариды, которые в зависимости от состава и строения могут быть гомополисахаридами и гетерополисахаридами, а при изучении производных углеводов - на гликозиды и аминосахара.

Изучение обмена углеводов, являющихся основным источником энергии, необходимой организму для его жизнедеятельности, следует начать с процессов в переваривания углеводов в органах пищеварения и всасывания. Далее необходимо рассмотреть роль печени в превращении моносахаридов в глюкозу, в синтезе гликогена и процессе ауторегуляции содержания глюкозы в крови, который дополняется нервно-гормональной регуляцией. В печени часть глюкозы используется на образование запасных отложений гликогена. Синтез и распад гликогена катализируется различными ферментами и контролируется независимо друг от друга. Часть глюкозы используется самой печенью для получения энергии, необходимой для протекающих в ней многочисленных реакций. Кроме того, определенное количество глюкозы в печени превращается в жиры.

Нужно знать роль инсулина, секретируемого b-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, являющегося единственным гормоном, обладающим резким сахаропонижающим действием. В настоящее время наиболее вероятной представляется мембранная локализация первичного действия инсулина. Имеются доказательства наличия специфического акцептора инсулина на внешней плазматической мембране жировых клеток и образования инсулин-рецепторного комплекса. Предполагается, что в жировых клетках и частично в клетках печени в передачах инсулиновых сигналов принимают участие аденилатциклаза и ц-АМФ. В мышцах инсулин легко проникает внутрь клетки. Без инсулина мышцы и печень не способны использовать глюкозу.

Кроме инсулина в обмене углеводов принимают участие и некоторые другие гормоны: глюкагон (гормон поджелудочной железы) и адреналин (гормон мозгового слоя надпочечников), которые способствуют активации глюкогенфосфорилазы печени и мышц, вызывая превращение гликогена в глюкозу (глюкогенез).

Здесь надо обратить внимание на фермент фосфорилазу, которая “переводит” полисахариды из запасной в метаболически активную форму – фосфорный эфир глюкозы. Фосфорилаза существует в двух формах, одна из которых фосфорилаза “а” – активная, а фосфорилаза “в” – неактивная. Обе формы могут диссоциировать на субъединицы. Неактивная форма “в”, состоящая из двух субъединиц, фосфорилируется в активную фосфорилазу “а” (содержащую четыре субъединицы) -киназу фосфорилазы.

Действие гликогенфосфорилазы на гликоген приостанавливается в точках ветвления до тех пор, пока не произойдет расщепление a-1,6 гликозидных связей, катализируемое ферментом амило-1,6-глюкозидазой. Образующийся под действием фосфорилазы глюкозо-1-фосфат превращается при участии фосфоглюкомутазы в глюкозо-6-фосфат.

Наиболее распространенным в животном организме является процесс анаэробного распада углеводов – гликолиз, который начинается с глюкозы.

Студент должен знать все последовательные реакции процесса, а также ферменты, катализирующие их и промежуточные продукты, которые образуются на пути превращения глюкозы в молочную кислоту, роль АТФ и фосфорной кислоты в этом процессе. Особенно нужно обратить внимание на сопряженную с фосфорилированием реакцию окисления фосфоглицеринового альдегида под действием глицеральфосфатдегидрогеназы. В результате этой реакции образуются восстановленный НАД и 1,3-фосфоглицериновая кислота, содержащая макроэргическую фосфатную связь, в которой аккумулировалась энергия окисления глицеральдегид-3-фосфата. Богатый энергией фосфорный остаток переносится с 1,3-дифосфоглицериновой кислоты на АДФ, образуя АТФ. Еще одна молекула АТФ образуется при превращении енолфосфопировиноградной кислоты в пировиноградную кислоту. Таким образом, при расщеплении одной молекулы глюкозы в процессе гликолиза образуются четыре молекулы АТФ и две молекулы молочной кислоты. При подведении энергетического баланса нужно учесть, что из четырех молекул АТФ одна расходуется на образование глюкозо-6- фосфата, а другая –  образование 1,6-дифосфата.